冠心病患者固醇调节元件结合蛋白-1与核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白1炎性体相关性研究

徐健强，王燕，盘艳君，喻思扬，曾高峰，赵国军

冠心病发病主要病理基础是动脉粥样硬化（AS）。AS发病机制极其复杂，与脂质代谢紊乱、炎症反应激活及内皮细胞功能失调等多因素相关[1-3]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白1（NLRP1）炎性体由NLRP1、半胱天冬酶（Caspase）-1及凋亡相关斑点样蛋白（ASC）三者组成。炎性体相当于一个活化Caspase-1的支架，活化的Caspase-1能够诱导白细胞介素-1β（IL-1β）及IL-18成熟[2,4]，参与多种炎症性疾病的病理进程[5]。本课题组前期研究发现，抑制固醇调节元件结合蛋白-1（SREBP-1）后，人急性单核细胞白血病（THP-1）巨噬细胞中NLRP1、IL-1β和IL-18表达均显著下降[6,7]，提示SREBP-1可能通过调控NLRP1炎性体参与冠心病进程。本研究观察冠心病患者外周血单个核细胞（PBMCs）SREBP-1与NLRP1炎性体的表达情况，进一步探讨二者之间的相关性。

1　资料与方法

对象：选取2015-07至2016-01体检中心20名健康志愿者（正常对照组）。选取同时间段内在本院行冠状动脉造影确诊冠心病患者104例（有1支及以上主要血管狭窄≥50%），其中稳定性心绞痛49例（SAP组）和急性冠状动脉综合征55例（ACS组），急性冠状动脉综合征包含不稳定型心绞痛（初发心绞痛、静息型心绞痛和劳力恶化型心绞痛）和急性心肌梗死。排除标准：肝功能异常；出现横纹肌溶解；合并肿瘤；合并肾功能不全且失代偿（血清肌酐浓度 ＞ 165 μmol/L，或血清肌酐清除率 ＜ 30 ml/min）；合并妊娠；严重心功能不全[纽约心脏协会（NYHA）心功能分级 ≥ 3级，或左心室射血分数 ＜ 35%）]；1个月内心肺复苏术病史；近3个月有重大外伤、手术史；1个月内使用他汀、抗生素、阿司匹林等影响炎性因子表达者；明显影响血流动力学的二尖瓣、主动脉瓣狭窄或关闭不全；合并急、慢性感染者；持续或频发室性心动过速，心室颤动患者。

方法：采血前禁烟、酒、茶、咖啡等24小时以上。次日清晨使用25 IU/ml肝素抗凝管，空腹肘静脉采血10 ml， 2小时内处理血样，分离血浆置于-20℃冰箱待检测，密度梯度法分离PBMCs，分置于两个无菌干燥离心管中，用于提取RNA及蛋白。血浆IL-1β、IL-18和高敏C反应蛋白（hs-CRP）检测采用酶联免疫吸附法（ELISA）。SREBP-1、NLRP1和Caspase-1的mRNA和蛋白分别采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和蛋白免疫印迹分析（WB），引物序列：人NLRP1：上游5’-TCT GGT TCA GGG ATG CTG GA-3’， 下 游 5’-GCA CTA GTA TCT CCT GGC GTC-3’， 人 Caspase-1：上 游5’-ACA TCC CAC AAT GGG CTC TG-3’， 下游 5’-TTC ACT TCC TGC CCA CCG AC-3’， 人 SREBP-1：上游 5’-TGA CCG ACA TCG AAG GTG AA-3’，下游 5’- AAA GTG CAA TCC ATG GCT CC -3’。

统计学分析：采用SPSS 20.0统计分析软件对数据进行统计学分析。计量数据以均数±标准差（±s）表示。两组组间数据分析采用Student's t 检验，三组或多组组间的数据采用单因素方差分析；相关分析采用直线相关分析法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2　结果

三组临床基线资料比较：SAP组和ACS组吸烟史、收缩压、舒张压、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯、总胆固醇与正常对照组比较差异均有统计学意义（P均＜0.05，表1）。

表1　三组临床基线资料比较（±s）

表1　三组临床基线资料比较（±s）

注：SAP：稳定性心绞痛；ACS：急性冠状动脉综合征；TG：甘油三脂；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；TC：总胆固醇。与正常对照组比较*P＜0.05。1 mmHg=0.133 kPa

血浆IL-1β、IL-18和hs-CRP的浓度变化：SAP组与ACS组血浆IL-1β、IL-18及hs-CRP浓度较正常对照组显著增高； ACS组血浆IL-1β、IL-18及hs-CRP浓度较SAP组显著增高，差异均有统计学意义（P＜0.05，表 2）。

表2　研究对象血浆炎症因子浓度比较（±s）

表2　研究对象血浆炎症因子浓度比较（±s）

注：SAP：稳定性心绞痛；ACS：急性冠状动脉综合征；IL:白细胞介素；hs-CRP：高敏C反应蛋白。与正常对照组比较*P＜0.05；与SAP组比较△P＜0.05

正常对照组　20　6.65±0.73　263.71±15.00　2.29±0.41

PBMCs内SREBP-1、NLRP1和Caspase-1的表达变化：SAP组与ACS组PBMCs内SREBP-1、NLRP1和Caspase-1的表达水平（包括mRNA和蛋白）均较正常对照组显著增高；且 ACS组患者PBMCs内SREBP-1、NLRP1和Caspase-1 的表达较SAP组显著增高，差异均有统计学意义（P＜0.05，图1A，图1B）。

图1　PBMCs内SREBP-1、NLRP1及Caspase-1 mRNA表达（1A）及蛋白表达（1B）

SREBP-1 与 NLPR1、Caspase-1、IL-1β 和IL-18表达水平相关性：PBMCs内SREBP-1 mRNA表达水平与 NLPR1（r=0.851，P＜0.05）、Caspase-1（r=0.874，P＜0.05）、血浆 IL-1β（r=0.891，P＜ 0.05）、血浆IL-18（r=0.664，P＜ 0.05）表达呈明显的正相关（图 2）。

图2　SREBP-1与NLRP1炎性体的相关性分析

3　讨论

AS是一种慢性炎症性疾病，炎症反应参与AS的发生、发展及并发症全过程[8]。AS病变早期，血液单核细胞受调控穿过血管内皮细胞，进入内皮下层，分化成为巨噬细胞[9]，吞噬修饰的氧化低密度脂蛋白胆固醇成为泡沫细胞，释放IL-1β、IL-18等炎性因子，进而促进AS的发展。IL-1β与IL-18在动脉粥样斑块中高度表达，可激活炎性通路增加AS斑块不稳定性，增大血栓事件发生概率[10，11]。本研究发现在冠心病患者血液中IL-1β和IL-18表达水平较正常对照组高，且ACS组比SAP组水平更高，进一步证实了IL-1β和IL-18参与AS的发展过程。

炎性体是位于一类细胞内的多蛋白寡聚复合体，NLRP1炎性体是Martinon等[12]在2002年发现的第一个炎性体。近年研究发现，NLRP1炎性体参与AS、系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等多种炎症性疾病的发生发展[13，14]。NLRP1炎性体活化后，Caspase-1裂解成熟，促进pro-IL-1β和pro-IL-18裂解形成具有活性的IL-1β和IL-18[15]。小鼠脑梗模型中，NLRP1、IL-1β及IL-18表达均明显升高，抑制NLRP1炎性体活化后，IL-1β和IL-18的表达下降，脑组织坏死面积减少[16]。体内抑制小鼠骨髓炎模型Caspase-1活性，IL-1β表达水平也相应下降[17]。在本研究中，冠心病患者PBMCs内NLRP1炎性体表达增加，且ACS组比SAP组水平更高，这与体内IL-1β和IL-18水平升高一致，说明NLRP1炎性可能参与了冠心病患者体内炎症水平的改变。

SREBPs属于膜转录因子家族，其编码基因有两个，SREBP-1和SREBP-2基因。小鼠体内SREBP-1还分为SREBP-1a和-1c两种亚型。SREBP-1主要调控脂肪酸和糖代谢，SREBP-2主要参与胆固醇合成。有研究发现，SREBP-1可参与调控肿瘤、脂肪变性及巨噬细胞介导的固有免疫应答等[18，19]。SREBP-1基因敲除后，由盲肠穿孔介导的内毒素休克和全身炎症反应受到明显抑制，NLRP1炎性体激活受阻，IL-1β和IL-18释放减少[20]。本课题组前期研究显示，使用siRNA抑制THP-1巨噬细胞SREBP-1后，NLRP1、IL-18和IL-1β表达均下降，说明SREBP-1能够激活NLRP1炎性体[7]。本实验发现血液PBMCs内SREBP-1与NLRP-1、Caspase-1、IL-1β和IL-18表达呈正相关，进一步证实了SREBP-1可能通过激活NLRP1炎性体，促进IL-18和IL-1β释放分泌，参与AS的发生发展。

值得指出的是，本研究存在一定局限性，首先，入选对象可能受主观因素干扰；其次，正常对照组与冠心病患者属非同类人群，并非严格的病例对照研究，可能造成一定的偏倚。

AS发病机制极其复杂，脂质代谢与炎症是其发生发展的重要原因，二者关系密切[21]，然而其内在联系尚未完全阐明。本研究不仅证实了冠心病患者SREBP-1与NLRP1炎性体表达升高，也进一步在体内确认了SREBP-1表达与NLRP1炎性体呈正相关关系，为以SREBP-1和NLRP1炎性体为靶点防治AS等炎症性疾病提供新的实验依据。

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