甜味蛋白特性及其表达的研究进展

何明娟，邹曙明，蒋霞云，刘宁

（上海海洋大学 食品学院，上海 201306）

甜味是深受人们喜爱的一种味觉，到目前为止，人类已经发现并使用的甜味剂大概有20种，可分为糖醇类甜味剂、非糖甜味剂、人工合成的非营养甜味剂三类。1968年，人们首次从植物果实中分离得到一种能将酸味变为甜味的蛋白质—Miraculin，从而开始了对天然甜味蛋白的研究和应用，但大自然植物中提取到的甜味剂种类较少，且工艺困难，使用率较低。

1 甜味蛋白的种类

迄今为止，已发现的植物甜味蛋白有8种，即Brazzein、Thaumatin、Monelin、Curculin、Mabinlin、Miraculin、Pentadin和新近发现的Neoculin。其中，Brazzein、Thaumatin、Monellin、Mabinlin、Pentadin这5种为甜味蛋白，它们本身就具有甜味；Miraculin和Neoculin为甜味诱导蛋白，具有甜味调节功能，可以使酸味等其他味感变为甜味；Curculin兼有前两类蛋白质的甜味特性。

1.1 Thaumatin

Thaumatin，又称索马甜、沙马汀，是从非洲竹芋科植物Thaumatococcus daniellii的果实中分离出的一类强烈甜味的蛋白质，为淡黄褐色至灰褐色粉末，无臭味，味极甜。Thaumatin甜味阈值为1.1 mg/kg，在高于甜味阈值浓度时，甜度为蔗糖的5 500～8 000倍[1]。Thaumatin均由一条多肽链组成，分子量约为22 kD，等电点在11.5～12.5，属于碱性蛋白，加热可发生变性而失去甜味，Thaumatin在酸性条件下热稳定性好，在碱性或中性条件下热稳定性相对较差。

1.2 Monellin

Monellin，中文被称为莫奈林，是从西非的一种植物Dioscoreophy Ilum cummitasii中分离得到的。Monellin分子由A、B两条链共94个氨基酸残基组成，A、B两条链通过非共价相互作用结合在一起。影响Monellin蛋白稳定性的因素有共价键作用力和非共价键作用力，蛋白表面的电荷和氨基酸残基会对它的甜味产生影响，尤其是Ca2+，这可能与味细胞中的Ca2+介导的阳离子通道有关。Monellin蛋白活性受温度和pH的影响，50 ℃以上、pH较低的条件下，蛋白失活，甜味降低[2]。

1.3 Mabinlin

Mabinlin，即马槟榔甜蛋白，是从中国云南等省的高海拔地区白花菜科植物Cappari Smasaikai Levi的种子中分离提纯到的一种甜蛋白。Mabinlin蛋白有4种同系物，分别为MabinlinⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，MabinlinⅡ相关的研究最多。MabinlinⅡ由A、B两条链组成，A链含有33个氨基酸残基，B链含有72个氨基酸残基。MabinlinⅡ热稳定性最好，甜度约是等质量蔗糖的400倍，其甜味在80 ℃至少可保持48 h不被破坏，而其他3种在80 ℃下保持0.5 h甜味就丧失[3]。

1.4 Brazzein

Brazzein，中文被译为布拉珍，是从非洲西部野生植物Pentadiplandra Brazzeana的果实中分离提纯得到的。Brazzein是由54个氨基酸残基组成的单链多态，相对分子质量为6.5 kDa，等电点为5，甜度约是等质量蔗糖的2000倍。Brazzein是一种单链蛋白，是在植物甜味蛋白家族相对分子量最小的。Brazzein甜味蛋白水溶解性、热力学稳定性和pH值稳定性都较好，Brazzein分子在85 ℃时仍保持折叠形式，即使在80℃下热处理4 h依然保持甜味活性，在高pH值溶液中也仍保持甜味活性[4]。

1.5 Pentadin

Pentadin，被译为培它丁，是1989年从非洲热带植物Pentadiplandra Brazzeana的果实中分离提取出的。其分子量为12 kDa，甜度为蔗糖的500倍，整个分子是以亚结构通过二硫键相连的。Pentadin和Brazzein来自同一种植物，Pentadin是果实经热干燥后提取得到的，Brazzein是从鲜果中提取得到的。Pentadin是非天然形态的交联Brazzein分子，分子量约为Brazzein的2倍，且甜度明显低于Brazzein[5]。

1.6 Curculin

Curculin，又称仙茅蛋白、库克灵，是从马来西亚石蒜科光叶仙茅植物Curculingo Latifolia的果实中分离得到的。它是一种不含糖基的单纯蛋白，有含114个氨基酸残基，等电点为7.1，对热敏感，50 ℃以上活性降低，其甜度约为等质量蔗糖的2 000倍。它的甜味消失后，可用柠檬酸或维生素C诱导恢复并产生强烈的甜味，其本身具有甜味又能使柠檬酸等有机酸变甜。

1.7 Miraculin和Neoculin

Miraculin，中文被译为奇异果素、奇果蛋白等。是从西非植物Richadelladulcifa Baehni的红色浆果中提取得到。Miraculin相对分子量约为24.6 kDa，是由191个氨基酸和N连接寡糖组成的单一多肽链，等电点约为9。Miraculin蛋白在100 ℃以下、pH 3～12范围内比较稳定，其本身并无甜味，遇到酸性物质后可以改变人的味觉，因此称其为矫味蛋白。

Neoculin是一种与Curculin同源且具有味道修饰作用的甜味蛋白，甜度约是等质量蔗糖的500倍。Neoculin是一种由一个N端糖基化酸性亚基NAS和一个基本单位NBS组成的异二聚体糖蛋白，Neoculin一维和三维结构均类似于单子叶植物中的甘露糖凝集素[6]。

2 甜味蛋白表达研究进展

2.1 Thaumatin的表达研究进展

研究人员在不断地进行Thaumatin的转基因表达，曾将Thaumatin基因转入不同的宿主，但都没有获得大量重组的具有活性的Thaumatin。2004年，孔建强等[7]利用基因工程技术，将分别克隆在两个不同载体上的甜味蛋白基因连接成一个完整的cDNA基因，并将该基因克隆进载体pBI121，通过冻融法导入农杆菌，再转入烟草植株，虽然在成熟烟草植株中检测到甜味蛋白目的基因，但并没有在转基因烟草中检测到表达的甜味蛋白。2007年，研究人员将基因导入到大麦中，大大提高了产量，平均每千克大麦可以产 2 g蛋白[8]。

2.2 Monellin的表达研究进展

Monellin蛋白已实现了在原核表达系统和真核表达系统中的表达。将Monellin在毕赤酵母中表达，并利用响应面优化了发酵培养基，但表达量较低，或存在产物活性偏低的现象。为了实现高效表达，学者多将研究重点转向根据大肠杆菌密码子的偏好性Monellin基因进行优化，获得了令人满意的结果。通过在Monellin蛋白中不同位点的氨基酸的丙氨酸取代获得突变体，并评估其热稳定性和甜味阈值的变化，其结果表明，通过基因突变技术可以改善天然Monellin蛋白的热稳定性和甜味，可以实现Monellin的工业化生产。

2.3 Mabinlin的表达研究进展

至今，对Mabinlin Ⅱ基因研究主要是在各种植物、原核生物中表达。研究人员已经成功地在根癌农杆菌的介导下将Mabinlin Ⅱ基因导入莴苣、西瓜、番茄中，通过分析，确定已将Mabinlin Ⅱ蛋白基因成功整合到重组植物的基因组中。2009年顾文亮等[9]对Mabinlin Ⅱ基因进行剪切重组，再克隆至大肠杆菌表达载体pET-30a(+)，将其导入大肠杆菌BL21（DE3）中表达，在IPTG诱导下，重组Mabinlin Ⅱ基因首次在大肠杆菌中表达。2011年王昌博等[10]将两种形式的重组Mabinlin Ⅱ导入大肠杆菌中表达，经诱导后成功表达，双盲测试可检测到轻微甜味和后甜感。

2.4 Brazzein的表达研究进展

Brazzein在原核生物中的表达主要集中在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和乳酸乳球菌，尤其是在以大肠杆菌作为表达菌的研究中，目的蛋白的产量及生物活性都有了很大提高。王长远等[4]为了提高甜味蛋白Brazzein的产量及甜度，将第29位的天冬氨酸、第31位的组氨酸和第41位的谷氨酸突变为赖氨酸、丙氨酸、赖氨酸，对编码区进行优化，构建甜味蛋白Brazzein的乳酸乳球菌表面表达系统，结果验证甜味蛋白Brazzein成功表达于乳酸乳球菌表面。赵红玲等[10]将含有Brazzein基因的pPIC9K穿梭质粒通过电转入巴斯德毕赤酵母GS115中，表达产物经电泳鉴定，其相对分子量与理论值一致，并得到有微甜味的表达产物。

2.5 Curculin、Miraculin和Neoculin的表达研究进展

现今关于Curculin的加工制备研究相对较少，对比于其他甜蛋白基因工程技术在仙茅蛋白表达中的应用相对滞后。研究表明，Miraculin的合成基因可以在在大肠杆菌中表达，也可在番茄中实现高效表达。目前尚未有成功表达Curculin的报道，但Neoculin已被成功表达，Nakajima等[6]利用带有KEX2剪切位点的α-淀粉酶分别与两个蛋白亚基融合，成功获得与天然Neoculin具有同样活性的重组Neoculin。

3 甜味蛋白鉴定方法和甜度测定方法

3.1 甜味蛋白的鉴定

常用的甜味蛋白鉴定分析方法有SDS-PAGE、免疫印迹及蛋白的质谱检测三种。将得到的甜味蛋白进行SDS-PAGE定性分析，探究重组基因是否在宿主内表达了目的甜味蛋白、甜味蛋白的分子量大小是否与预估值相符、也能做简单的定量分析。将SDSPAGE上的纯化后的蛋白使用免疫印迹分析鉴定基因是否表达。将SDS-PAGE上的纯化后的蛋白使用MALDI-TOF/TOF串联质谱进一步分析鉴定，确定蛋白的氨基酸序列。

3.2 甜味蛋白的甜度测定

甜味蛋白是一种新型的甜味剂，甜度测试方法一般采用双盲检测法。将100 mL发酵液在4 ℃条件下，以5 000 r/min冷冻离心5 min，收集的细胞加10 mL无菌去离子水重新悬浮。冰浴中100 W超声波破碎15 min，超声3 s，停止3 s。菌液在4℃以12000 r/min冷冻高速离心20 min，收集上清液。用0.25 μm孔径滤膜的过滤器过滤，取少量滤液进行活性测试，同时针对阴性对照和目的甜味蛋白的上清液，采取多人员进行双盲测试，感官评定比较其甜度。

4 挑战与前景

传统的天然植物蛋白的产量不高，研究人员为获得安全高产量的甜蛋白利用分子生物学技术克隆其编码区，运用基因工程技术，根据氨基酸序列人工合成甜味蛋白基因，然后将甜味蛋白基因转入微生物或高等植物中进行外源表达。在这些研究进行的过程中，想要应用基因工程技术生产甜味蛋白，重组质粒的稳定性、基因工程菌的稳定性、目的基因在宿主中能否表达，基因表达的诱导条件、所表达的蛋白的甜味活性以及寻找甜味的科学检测方法，都是需要面对和克服的困难。虽然微生物发酵生产甜味蛋白仍处于实验阶段，但随着酵母、大肠杆菌等表达系统研究的不断深入，利用基因工程菌生产甜味蛋白具有极其诱人的前景。