小麦细胞色素P450基因克隆及其序列研究

高璇

（山东农业工程学院，山东济南250000）

细胞色素P450广泛地分布在动物、植物和微生物中。P450在高等植物的微粒体、液泡膜、线粒体膜等中大量存在，其中在微粒体中的含量最高。植物的各器官中，叶片中含有的细胞色素P450最高，其次是花朵、茎中。植物细胞色素P450对植物本身有着非常多作用，有助于植物新陈代谢，合成或分解激素，还能抵御生物以及非生物胁迫，用于合成花粉孢粉素等。

1 细胞色素P450的发现

1969年，D.S.Frear等人首次在棉花中发现了细胞色素P450，随后在更多的植物中发现了P450，如小麦、水稻中[1]。根据现阶段的研究成果，P450的基因数目占据了物种总基因数目的1%，说明了细胞色素P450基因的多样化。小麦作为我国主要的粮食作物之一，在生长过程中，P450基因发挥着重要的作用，能提升小麦的抗逆性，丰富其抗性基因资源。参照以往的小麦细胞色素P450研究成功，发现小麦P450能解毒和促进代谢和氧化等。Cabello-Hurtado等人从小麦中提取了编码钝叶醇的CYP51基因，酵母中表达该基因，能增强羊毛甾去甲基化的活性[2]。Forthoffer等人研究认为，有3个及以上的P450参与了除草机解毒过程，除草剂的毒性能提升P450的活性[3]。小麦中的一个P450基因和赤霉病的抗性也有着密切的联系，这个P450基因在抗性品种中的表达量非常高，说明P450基因对于小麦解毒和防御起着积极的效应。

2 试验材料和方式

2.1 试验材料

本次研究材料选择某小麦品种，使用Trizol试剂盒，RACE试剂盒(美国Invitrogen公司），从Fermentas公司购入反转录试剂，另外试验用到的Ex Taq酶、pMD18-T载体从Transgen公司购入。

2.2 试验方法

2.2.1 提取小麦基因组DNA和总RNA

使用Trizol方法提取小麦叶片中的RNA，使用CTAB方法提取基因组中的DNA，根据反转录试剂盒对RNA进行反转录，得出完整的cDNA链，并将其在-20℃的环境下保存。

2.2.2 克隆TaP450基因

使用已知的小麦P450基因序列在数据库中搜索，将得出的序列进行拼接比对，获取到68个Contig，选出和已知小麦P450基因差异较大的序列研究。研究中将该拼接序列作为模板，并设计引物TaP450-S和TaP450-A，其中TaP450-S的序列为5'-CCTCTTCCTGCTCCACTACA-3'；TaP450-A 引 物的 序 列 为5'-GCCTTATTACGCCAACAACGC-3'[4]。用小麦叶片cDNA作为模板进行PCR的扩增。在94℃下预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，75℃延伸10min，对目的条带连接pMD18-T载体进行测序，依照测试结果设计5'-RACE引物和3'-RACE引物，进行RACE扩增，连入pMD18-T进行载体测序，拼接获得TaP450基因的全长cDNA序列。

2.2.3 TaP450基因生物信息学分析和基因组序列克隆

使用ExPASy软件，对TaP450基因编码蛋白的分子量等进行分析。在对Ta基因组序列进行克隆时，以小麦叶片中基因组DNA作为模板，使用引物TaP450-gS（序列：5'-AGAAGAGATGAACCACGAA-3'）以及TaP450-gA（序列：5'-GCCTTATTACGCCAACAAGC-3'）进行PCR的扩增，反应程序是94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃时退火30s，72℃时延伸5min，30个循环，72℃时延伸10min。将扩增片段连入到pMD18-T载体进行测序，从而获得TaP450的基因组序列[5]。

2.2.4 TaP450组织特异性表达和胁迫处理表达

将小麦叶子、茎部、根部以及种子的总RNA提取，经过反转录得到cDNA，用小麦Actin基因为内参，检测TaP450在小麦不同部位的相对表达量。对TaP450进行胁迫处理时，选用状态一致小麦，使用200mmol/L的NaCl浸泡24h，20%的PEG6000浸泡24h，用100μmol/L的ABA叶面喷施，恢复生长24h。损伤叶子恢复生长24h。提取叶片总RNA，反转录得到cDNA，检测TaP450在多种胁迫下的相对表达量[6]。

2.2.5 半定量RT-PCR检测

用小麦的Actin作为内参，使用TaActin-S（序列：5'-AGCCATACCGTGCCAATC-3'）和引物TaActin-A（序列：5'-AGAGCCTCCAATCCAGAC-3'），反应程序是94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，经过28个循环后在72℃下延伸10min，根据TaP450基因设计引物TaP450-RTS（序列：5'-ATGTCAGAGGAGGCCCAGGAGTTCA-3'）和引物TaP450-RTA（序列：5'-ATGTCAGAGGAGGC CCAGGAGTTCA-3'），实施组织器官表达和胁迫处理表达，反应程序在94℃下预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，经过28个循环后72 ℃延伸 10min。

3 结果与分析

3.1 TaP450基因克隆和序列分析

PCR扩增后得到长为1546bp的目的条段，这片段序列和拼接序列大致相同，存在3个碱基差异。对5'-RACE和3'-RACE扩增后将三条序列拼接，得到长为2033bp的DNA片段，这个片段有长度为1557bp的开放读码框，有polyA尾[7]。

3.2 TaP450编码蛋白生物信息

TaP450基因编码蛋白中的氨基酸数量有518个，分子量是57.092kD，等电点是8.63。TaP450蛋白N端有长度29的氨基酸跨膜结构和长度22的氨基酸信号钛。通过分析得出该蛋白是分泌蛋白，和已知的P450蛋白比对，该蛋白和已知的P450蛋白的氨基酸序列不同，存在着很大差异，序列相似性低。

3.3 TaP450基因组序列克隆分析

用小麦基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，得到长度为2643bp的DNA片段。经过对比发现基因组序列中有长度为1086 bp的内含子，两个外显子的长度分别为942bp和615bp。

3.4 TaP450基因特异性表达和胁迫表达

经过分析后发现，TaP450基因在小麦中的多个部位都有表达，其中在小麦的叶片中的表达量最高，在小麦的根部的表达量较低。胁迫表达分析方面，设置了不同的胁迫条件，对不同环境下TaP450表达量变化作出了检测。通过对检测结果的研究，发现TaP450在受到盐、机械损伤后，表达量出现明显的上调。经过PEG6000以及冷处理时，表达量的变化不明显[8]。对比得出结论，说明TaP450基因对盐、机械损伤等比较的敏感，对冷处理等不敏感。不同胁迫处理后，发现TaP450基因对盐胁迫最为敏感，得出TaP450基因和盐胁迫的关系密切。

4 结语

P450作为一种氧化酶，有着强大的功能，能促进小麦的新陈代谢，并有着解毒的功效。本次研究中从小麦中提取了一个新的P450基因——TaP450，这个新的TaP450基因和已知的P450基因存在着较大的差异性，并且TaP450基因在小麦的各个部位都有表达，其中在小麦的叶片和颈部的含量最高，在种子以及根部的表达量较低。受到多种环境胁迫时，发现TaP450基因对机械损伤在盐胁迫下的表达量上调较为明显，其中以在盐胁迫下的表达最为显著，说明了TaP450基因和逆境胁迫相关。研究中，TaP450基因在水杨酸处理下上调，表明了该基因在一定程度上能增强小麦的抗病性。通过对小麦的蛋白序列进行分析，发现TaP450蛋白N端的信号钛，证明了属于分泌蛋白。对TaP450基因的克隆和表达分析，发现了新的P450成员，为增强小麦的抗逆性提供了帮助。