星斑川鲽(♀)与石鲽(♂)杂交子代胚胎发育研究

马贵范，刘振华，田永胜，王 波，孙宗哲，李祥孔,5，宋莉妮,6，李 洪,6

(1.威海海洋职业学院,山东 荣成 264300; 2.中国水产科学研究院 黄海水产研究所,农业部海洋渔业可持续发展重点实验室,山东 青岛 266071; 3.国家海洋局 第一海洋研究所,山东 青岛 266000; 4.蓬莱宗哲养殖有限公司,山东 蓬莱 265617; 5.大连海洋大学,辽宁 大连 116023; 6.上海海洋大学,上海 201306)

星斑川鲽(Platichthysstellatus)和石鲽(Kareiusbicoloratus)同为鲽形目、鲽科，分属于川鲽属与石鲽属。星斑川鲽主要分布在北太平洋的亚洲和美洲沿岸海域[1-3]，于2000年突破人工育苗技术，因其具有食性杂、耐低氧、生长快、成活率高、适合集约化养殖等优势而颇受市场关注[4-10]。石鲽主要分布在我国黄渤海海域和日本、朝鲜等海域，人工繁殖技术于1991年取得成功，该鱼具有耐低温、抗逆性强、饵料利用率高和养殖成本低等优点，成为近年来工厂化和网箱养殖的主要品种之一[11-12]。但近几年种质退化和养殖环境恶化而引起病害频发、死亡加剧，导致养殖效益下滑[13]，因此养殖品种改良已成当务之急。

应用杂交理论与技术对鱼类进行良种选育已有100多年的历史[14]，杂交不仅能丰富物种的遗传结构，还能迅速和显著地提高后代杂种优势，通过亲本基因的分离和重组可筛选出具有双亲优良性状的杂交后代[15]，所以杂交成为动物育种的主要手段之一。在鲆鲽鱼类中，远缘杂交已见于欧洲鲽(Pleuronectesplatessa)×大西洋庸鲽(Hippoglossushippoglossus)[16]，褐牙鲆(Paralichthysolivaceas)×圆斑星鲽(Veraspervariegates)[17]，浦氏光鲽(Liopesettaputnami)×美洲拟鲽(Pseudopleuronectesamericanus)[18]，圆斑星鲽×石鲽[19]等。Yamashita等[20]报道了星斑川鲽与石鲽杂交子代的变态发育，但尚未见对二者杂交子代胚胎发育生物学方面的研究报道。因此，笔者以星斑川鲽为母本，石鲽为父本，进行了二者的属间远缘杂交，并对杂种的胚胎发育过程进行了研究，以期丰富二者杂种后代的基础生物学，为杂种优势的获得提供科学依据；另一方面充分利用杂种优势以期调整鲆鲽鱼类养殖结构，丰富养殖品种。

1 材料与方法

1.1 材料

2015年4月在蓬莱宗哲水产养殖有限公司进行星斑川鲽和石鲽杂交试验，试验所用亲鱼为人工养殖培育，星斑川鲽(♀)质量1500 g，石鲽(♂)质量500 g，经过温度、光照以及营养调控，亲鱼经注射人绒毛膜促性腺激素和促黄体激素释放激素催产24～48 h后，通过腹部挤压方法获得成熟的卵子和精液，进行干法受精。具体过程为：通过目测观察，挑选腹部隆起较高的雌鱼，用抄网轻轻捞起，手轻压腹部感到柔软则性腺发育成熟。挑选出成熟亲鱼后，用纸巾将生殖孔附近的海水擦拭干净，开始轻压腹部将卵挤到烧杯中，同时挑选成熟较好的雄鱼，采集精液，加入星斑川鲽卵中，将精液与卵混合均匀，加入2倍于卵的过滤海水激活受精。受精完成后10 min加入适量海水，待受精卵充分上浮，使用200目筛绢漂洗、过滤收集上浮受精卵，均匀分布在控温网箱中，控制孵化水温为13～14 ℃，同时充气增氧。

1.2 胚胎发育观察方法

利用DCM130-2.0显微电子成像系统观察受精卵胚胎发育情况并拍照。详细记录各时期发育特点及发育时间，并统计受精与孵化数据。借助XTZ-D体视显微镜进行辅助拍摄。

1.3 统计方法和胚胎发育畸形观察

人工受精2.5 h后，从受精卵中随机抽取30～50粒，以是否发育到卵裂期作为受精的标志，统计卵的总数和受精卵的数量，计算受精率。从受精卵中随机抽取约200粒放入1 L烧杯中，在恒温培养箱中13～14 ℃培养，统计孵化率。胚胎发育的过程中，分别在卵裂期、原肠期、胚体出现期、肌节期、尾芽期、出膜期随机抽取30～50粒胚胎进行镜检，观察和记录胚胎发育的情况，统计发育畸形的胚胎数量，计算胚胎发育的畸形率。

1.4 图片制作和数据处理

利用Photoshop 7.0制作胚胎发育图片，采用Excel 2010对数据进行统计分析。

2 结 果

2.1 受精卵与受精率

星斑川鲽与石鲽杂交后代的受精卵为圆球形，呈淡黄色，略透明，卵膜较薄，膜间隙约为12～14 μm，半浮性，无油球，受精卵的平均卵径为1.02 mm。受精10 min后加入一定量的海水，会发现正常受精或发育良好的受精卵上浮，过熟或未受精的受精卵则下沉。经统计，星斑川鲽(♀)与石鲽(♂)杂交的受精率为(15.6±0.02)%。

表1 星斑川鲽(♀)与石鲽(♂)杂交的受精率、孵化率及畸形率

2.2 胚胎发育

2.2.1 卵裂期

受精后2.5 h，受精卵(图1a)开始第一次卵裂(经裂)。卵裂的方式为盘状卵裂，即卵子的原生质集中在动物极的一小部分区域，并稍微隆起形成帽状的胚盘，卵裂只在胚盘中进行，卵黄不参与卵裂。首先胚盘中部凹陷形成分裂沟并加深延长，形成两个大小相等的分裂球，进入 2 细胞期(图1b)。4 h后受精卵进行第二次卵裂，仍为经裂，出现与第一次卵裂方向相垂直的分裂沟，形成 4 个大小近似相等的细胞，细胞排列紧密，进入 4 细胞期(图1c)。第二次卵裂结束0.5 h后发生第三次卵裂，分裂沟方向与第一次卵裂相平行，每个细胞一分为二分裂为8个细胞(图1d)。第四次卵裂出现在受精5 h，左右两列细胞继续分裂，每个细胞横裂为 2 个细胞，每列 8 个共 16 个细胞，胚体进入 16细胞期(图1e)。2 h后，发生第五次卵裂，分裂沟消失，分裂球更小，进入32细胞期(图1f)。第六次卵裂即32细胞变为64细胞(图1g)时，开始第一次纬裂，细胞分为两层，自此细胞经裂、纬裂交替进行，卵裂不同步，分裂球大小、形状不规则，进入多细胞期，直至受精后12 h，进入桑葚期(图1i)。

2.2.2 囊胚期

随着细胞继续分裂，囊胚腔形成，分裂球增多胚盘隆起并逐渐达到最高，形成了类似帽状的高囊胚(图1j)，此期与桑葚期相比细胞数量明显增多，体积变小，排列不规则，界限不清楚。随后隆起的高囊胚层细胞逐渐沿着卵黄囊表面向四周下包，囊胚层的高度不断降低，囊胚边缘细胞增多，进入低囊胚期(图1k)。

2.2.3 原肠期

在受精后26 h囊胚层的细胞开始向植物极下包，双胚层形成，并在此基础上组织器官开始分化，当囊胚下包到卵黄的1/3位置处，囊胚层外周的边缘有大量细胞积聚，形成胚环，即进入原肠早期(图1l)；随后囊胚继续下包，下包至卵黄1/2位置时，进入原肠中期(图1m)；胚层下包到卵黄3/4处，胚环明显缩小，植物极方向仅漏出小部分卵黄，胚孔形成，进入原肠晚期(图1n)。

表2 星斑川鲽(♀)与石鲽(♂)杂交胚胎发育时序水温(13 ℃)

2.2.4 器官形成期

受精后48 h，杂交的胚孔关闭，出现胚体，胚体匍匐在卵黄上，围绕卵黄1/3(图1o)；7 h后明显可见头部，并在其背部出现脊索(图1p)；受精后58 h胚体上可见均等的凹陷，为肌节出现期(图1q)，胚体中肌节4～5对，脊椎形成，同时在胚体尾部出现末球；随着头部器官的进一步分化，受精后70 h视胞形成，并出现雏形心室(图1r)；79 h心胞形成，听囊内出现雏形耳石(图1s)；受精83 h，胚体尾部向后发育进一步延长形成尾芽，此时末球消失，脊椎明显，肌节数增至11～14对，胚体绕卵黄约3/4(图1t)；受精后87 h，心脏开始有规律地搏动，血管清晰，贯穿鱼体前后部，血管血液循环明显(图1u)，4 h后鱼体开始抽搐式运动，尾部进一步发育延长，鱼体绕卵黄超过一周，听囊中的耳石明显可见，胚体不断抽动和尾部摆动，使其在卵膜内旋转并抽搐式运动(图1v)。

2.2.5 破膜期及孵化率

胚胎发育进入孵化期后，卵膜薄而透明，随着胚体摆动与扭动频率和幅度不断加大，胚胎与卵膜分离，胚体的剧烈运动对受精卵的内壁产生足够大的压力，不久即破膜而出(图1w)。破膜时一部分胚体头部先脱离卵黄，但尾部仍继续摆动直至完全脱离卵黄，另外一部分是尾部先脱离卵黄，头部最后脱离出来。杂交后代的孵化率为(42.1±0.23)%。

2.3 杂交胚胎畸形观察

在星斑川鲽(♀)与石鲽(♂)杂交后代胚胎发育期间，观察了畸形胚胎发育情况，畸形率为(57.1±0.03)%。畸形胚胎发生的胚胎时期及畸形胚胎的形状、特征见表3。

表3 星斑川鲽(♀)与石鲽(♂)杂交胚胎发育畸形现象

3 讨 论

3.1 鲆鲽类杂交受精率与孵化率比较

有学者认为，鲆鲽类进化较晚，在科属间进行杂交从而获得具有优良品质的杂交后代具有较大的可行性[14]。根据现有的研究成果，除星斑川鲽(♂)×大菱鲆(Scophthalmusmaximus,♀)杂交不能获得正常发育的个体外[21]，星斑川鲽(♀)×圆斑星鲽(♂)杂交后可发育至卵裂期的为11%[22]；星斑川鲽(♀)×条斑星鲽(V.moseri,♂)杂交后代的受精率可达65.7%[22]；星斑川鲽(♀)×钝吻黄盖蝶(P.yokohamae,♂)的受精率和孵化率较高[14]；说明以星斑川鲽为亲本可以与多种鲆鲽鱼类杂交产生后代。本研究中，虽然星斑川鲽(♀)×石鲽(♂)的受精率(能发育至卵裂期)仅为15.6%，但孵化率相对较高，可达到42.1%，说明星斑川鲽与×石鲽进行杂交育种具有较高的潜力，Yamashita等[20]的研究也表明星斑川鲽与石鲽杂交可以培育出新品种，并且杂交后代的生长速度介于两亲本生长速度之间。

图1 星斑川鲽(♀)×石鲽(♂)的杂交胚胎正常发育a：受精卵；b：2细胞期；c：4细胞期；d：8细胞期；e：16细胞期；f：32细胞期；g：64细胞期；h：多细胞期；i：桑椹期；j：高囊胚期；k：低囊胚期；l：原肠早期；m：原肠中期；n：原肠后期；o：胚体出现期；p：脊索出现期；q：肌节出现期；r：视胞形成期；s：心胞形成期；t：尾芽形成期；u：心脏开始跳动；v：抽搐期；w：破膜期.

图2 星斑川鲽(♀)×石鲽(♂)的杂交的畸形胚胎a：卵裂不正常；b：胚孔关闭受阻；c：发育缓慢；d：胚体出现断裂；e：尾部伸展不正常；f：尾部发育不正常；g：出膜后发育不正常.

3.2 星斑川鲽(♀)×石鲽(♂)的孵化时间

3.3 星斑川鲽(♀)×石鲽(♂)的胚胎发育特点

星斑川鲽和石鲽的成熟卵子均为半浮性卵，无油球，卵膜光滑透明而薄，受精卵发育时间长，星斑川鲽(♀)×石鲽(♂)胚胎发育时序和发育特征与其他鲽科鱼类杂交组合基本相似，大致分为卵裂、囊胚、原肠胚、器官形成、脱膜孵化5个时期[15,22]。因为鱼类胚胎发育具有种的特异性[26]，导致不同鱼类的胚胎发育各不相同。与亲本比较，杂种的胚胎发育在每个阶段内的详细发育分期上有所不同，主要有以下特点：(1)杂交后代囊胚阶段持续时间较长(8 h)，星斑川鲽自交高囊胚期和低囊胚期仅持续2 h；(2)杂交后代原肠胚阶段持续时间较短(16 h)，星斑川鲽自交原肠胚开始到胚体器官分化需要24 h；(3)杂交后代、星斑川鲽自交胚胎[22]及石鲽自交胚胎[26]均在心跳发生以后开始出现胚体扭动，但杂交后代心脏搏动至破膜期发育时间较短，仅需要11 h。

3.4 胚胎畸形的发生现象

考虑到本杂交组合为属间杂交，与一般自交不同的是，除正常发育胚胎外，还出现因杂交两亲本遗传特性不同，如繁殖习性和生态习性的差异，杂交后胚胎停止发育和畸形率较高(57.1%)。这些胚胎在细胞分裂期、原肠期、尾芽形成期、破膜期等出现异常，如细胞分裂不正常、分裂细胞大小不一，细胞排列不规则，胚孔封闭受阻，胚体出现断裂，胚胎发育迟缓甚至停止，尾部发育不正常导致不能歪曲，脊索向后伸展不正常，破膜受阻，不能孵化成初孵仔鱼等。本研究较详细观察了这些现象，而在其他属间杂交组合中未见报道。

4 结 论

在脊椎动物中，鱼类是较易发生杂交的动物之一，前人的研究中已产生了不少具有生产或育种价值的杂交种，杂交已成为鱼类育种的重要手段。海水鱼类的繁殖中较少使用杂交手段，海水鲆鲽鱼类中目前已进行了海鲽(♀)×河鲽(♂)(Pleuronectesflesus)、欧洲黄盖鲽(♀)(Limandalimanda)×川鲽(Platichthysflesus)(♂)、海鲽(♀)×大菱鲆(♂)、河鲽(♀)×大菱鲆(♂)、圆斑星鲽(♀)×石鲽(♂)、漠斑牙鲆(♀)(Paralichthyslethostigma)×白点牙鲆(♂)(P.albiguta)之间的杂交等[19]。星斑川鲽和石鲽同属于鲽形目、鲽科，从分类学的角度二者间的杂交属于远缘杂交，从地理位置看二者杂交属于地理远缘杂交。分类地位越相近的物种杂交，理论上成功的可能性就越大；而地理上的远缘杂交，不仅后代变异幅度大、类多而且常常出现一些珍贵的超亲性状和超亲类型，而且其后代性状也较稳定[28]，以上构成了选择星斑川鲽、石鲽作为亲本的理论依据。在星斑川鲽(♀)与石鲽(♂)杂交试验中，杂交受精率为15.6%，杂交胚胎中有一定量的畸形胚胎(57.1%)，能够正常发育胚胎的孵化率可达到41.2%，说明星斑川鲽(♀)与石鲽(♂)的杂交是可行的，两亲本相容性较好。但目前对星斑川鲽(♀)×石鲽(♂)杂交后代的研究有限，对杂交子一代各方面特性的了解还不够充分，有关杂交子一代在生长、抗逆性和抗病等方面的生物学特性，以及杂交后代与亲本在表型性状、遗传性状等方面的区别，还有待进一步的研究。

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