1例痤疮患者面部细菌的分离鉴定及耐药分析

张 婧,郝羽翀,王 雨*

(1.吉林大学第一医院，吉林 长春130021;2.吉林大学基础医学院)

面部痤疮是多种机制共同作用的结果，它的发生主要与皮脂腺分泌过多、细菌感染、毛孔堵塞以及炎症过敏等方面有关，除此之外还与遗传或者心理压力等因素息息相关[1]。我们从一例临床患者面部痤疮位置分离得1株细菌，对其进行分离纯化并结合理化特性进行鉴别，以期对痤疮患者的病因有更深一步的认识。

1 病例摘要

患者女性，年龄23岁，于2017年3月就诊于吉林大学第一医院皮肤科，患者的痤疮病程为1年零2月，临床确诊为面部痤疮患者，近3个月内参加过其他面部临床研究或接受过皮肤科医生治疗，皮损形态有粉刺及囊肿。病情分度依据Pillsbury分类法,确定为中度(Ⅱ)[2]。用无菌棉签收集患者痤疮破处液体，并在无菌生理盐水中进行溶解稀释。取含菌的生理盐水50 μl均匀涂布在血平板上，分别在有氧及无氧条件下，37℃过夜培养。利用厌氧罐培养法，在血平板进行培养，37 ℃过夜后，痤疮丙酸杆菌的菌落形态呈灰白色或淡红褐色，菌落约针尖大小，有凸起，表面光滑呈圆形[3]。菌落形态如图1。挑取血平板上的单个菌落进行革兰染色[4]，在100倍油镜下进行观察并拍摄。痤疮丙酸杆菌革兰染色呈阳性(Gram+)，不产芽孢营养类型为异养厌氧型，适应性极强，能适用多种复杂环境。在100倍油镜下观察，细菌呈短杆状，革染呈紫色，为典型的革兰阳性菌[5]。油镜观察结果见图2。利用经典菌落PCR方法分析鉴别细菌类型，确定从患者病患处分离纯化得一株厌氧菌，经梅里埃细菌鉴定系统鉴定，后参照Negin NAGHDI等人的文献[6]，以5′-AGCTCGGTGGGGTTCTCTCATC-3′，5′-GCTTCCTCATACCACTGGTCATC-3′为引物，PCR 反应体系为50 μl，包括上、下游引物各0.4 μmol/L，模板2 μl，2×Taq Master Mix 25 μl。反应条件为95 ℃预变性2 min;95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延长1 min，共35 个循环； 72 ℃终末延长5 min。在PCR循环条件下行菌落PCR， 1%琼脂糖凝胶电泳分离，并对PCR产物进行序列测定，经BlastN比对测序结果[7]，按上文条件进行PCR后电泳结果如图3，条带大小为1 202 kb，测序结果显示该株细菌为丙酸痤疮杆菌，并命名为P.acnes1。为确定菌株对抗生素的敏感性，以便合理用药，对所分菌株进行耐药性分析。耐药性测定系对PCR序列分析后确定为丙酸痤疮杆菌的菌株经平板稀释法测定其对抗菌药物的耐药性[8]，每种药物浓度均设50、100、200及400 μg/ml 4个浓度。平板结果显示，P.Acnes1对检测的14种抗生素中的5种耐药，9种敏感抗生素为头孢吡肟、头孢米诺、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢曲松钠、克林霉素、盐酸莫西沙、盐酸左氧氟沙星和硫酸庆大霉素。在耐药的5种抗生素中，阿奇霉素、头孢西丁钠和头孢他美的耐受浓度为200 μg/ml，亚胺培南和氨苄西林钠的耐受浓度为50 μg/ml[9]。药敏试验结果见表1。

2 讨论

痤疮是一种毛囊皮脂腺的慢性炎症，好发于青年。其发生主要与皮脂分泌过多、毛囊皮脂腺导管堵塞、细菌感染和炎性反应等因素密切相关[10]。Wang 等[11]将痤疮患者鼻部皮肤微生物与痤疮丙酸杆菌共同培养后发现表皮葡萄球菌可抑制痤疮丙酸杆菌，实验结果表明，也许可以通过微生物间相互抑制达到治疗痤疮的目的。研究表明该疾病对患者自我形象和生活质量影响程度很大[12]。本例患者面部油脂分泌量明显高于正常人，病程约一年，无痤疮家族史，痤疮瘢痕主要位于鼻部及下颌，对口服及局部治疗药物反应性差，属迟发型痤疮。

本实验通过传统的临床菌株分离[13]，获得一株在无氧条件下，在血平板上长势良好，在有氧条件下无法生长的细菌，经过革兰染色确定为紫色短杆菌，表现为典型的革兰阳性细菌特征[14]。结合其生长条件，判断为丙酸痤疮杆菌，黄小芳等的文章中提及，痤疮丙酸杆菌是一种革兰染色的厌氧短杆菌，细胞内寄生，属于皮肤的正常菌群，一般寄居在皮肤的毛囊及皮脂腺中。随着青少年的发育成熟，毛囊口出现角栓，皮脂腺分泌功能也明显增加，因皮脂含有较多脂肪酸等成分，适合P.acnes的生长及繁殖，从而成为痤疮最主要的病因之一[15]。利用丙酸痤疮杆菌的保守序列设计引物，进行菌落PCR并结合电泳和测序分析，确定为一株丙酸痤疮杆菌。在NCBI中进行BlastN操作，与已公布的序列进行比对，一致性在99%，确定为丙酸痤疮杆菌[16]。

图1P.acnes1在血平板上的形态图2经过革染的P.acnes1在100倍油镜下形态图3PCR电泳结果

表1 P.Acnes1的耐药性测定结果

—”表示不耐药,数字代表耐受的药物浓度

痤疮的发生与痤疮丙酸杆菌的感染密切相关，口服抗生素是治疗重型痤疮有效的方法之一。国际上痤疮治疗共识推荐第二代四环素类药物包括米诺环素、多西环素等作为痤疮抗菌治疗的首选药物，其次是第一代四环素类药物。针对该株细菌的药敏性实验，设定50、100、200及400 μg/ml四个浓度梯度，选用14种常见抗生素进行平板梯度稀释实验，结果显示P.acnes1对14种抗生素中的5种有抗性，但并不能对三类(氨基糖苷类、红霉素、β-内酰胺类)或三类以上抗生素同时耐药，故并非为多重耐药菌[17]。通过对该株细菌的鉴定以及耐药性分析进一步的了解了患者的病因，以期进行更好的护理。确保患者的依从性、选用有治疗靶点的抗生素及足够的治疗疗程是治疗取得成功的关键。提高痤疮患病早期就诊率是预防重型痤疮发生的基础；为患者提供安全、有针对性、足够疗程的综合治疗是提高痤疮治疗效果的关键。以正确的态度对待，保证积极乐观的精神状态，并注意调整饮食结构，注重面部的清洁卫生，保持良好的生活习惯，为早日治愈打好坚实基础[18]。

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