大肠癌组织中PDIA3的表达及意义

孙景春，师庆红，石 宇，宋丽娜

(吉林大学中日联谊医院 检验科，吉林 长春130033)

蛋白质二硫键异构酶A3(PDIA3)，也被称为ERp57,是一种58kD的葡萄糖调节蛋白，是属于PDI家族的硫醇氧化还原酶伴侣蛋白[1]。该分子涉及多种细胞功能，包括新合成的蛋白质的折叠和主要组织相容性复合物I(MHC-I)的装配[2,3]。在人类的卵巢癌、乳腺癌、子宫癌、肺癌、胃癌和前列腺癌中都有PDIA3的表达[4-6]。本研究对PIDA3在大肠癌组织中的表达情况及其在细胞内的定位进行初步探讨。

1 材料和方法

1.1研究对象

本试验研究对象为2015 年10月至2016年12月期间在吉林大学中日联谊医院手术治疗的大肠癌患者，共计20例。取其术中切除的癌组织及癌旁肠黏膜组织标本(距癌组织均大于10 cm)，液氮速冻后备用。所有肿瘤组织标本术后经病理学证实均为TNMⅢ期腺癌。

1.2试剂与仪器

蛋白定量试剂盒购自BIO-RAD公司；测序级胰酶、RNA酶、DNA酶、兔抗人PDIA3多克隆抗体、HRP-羊抗兔IgG和考马斯亮蓝G-250购自美国西格玛公司；蛋白抽提试剂盒购自CW Bio公司；免疫印迹化学发光试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；其他化学试剂购自北京化学试剂厂。

Agilent 1200高效液相色谱仪购自美国安捷伦公司；LTQXL离子肼质谱仪购自美国赛默飞公司。

1.3方法

1.3.1将组织样本从液氮中取出，剪碎，在液氮中研磨。提取组织样本的总蛋白质。用考马斯亮蓝法(Bradford法)测定上清液中的蛋白质浓度。操作过程按试剂盒说明书进行。

1.3.2制备组织样本的蛋白质酶解多肽混合物，采用二维色谱与质谱联用技术进行检测分析。离子肼质谱仪的检测范围为质核比400-2 000 amu，本研究采用数据依赖的方式进行次二级质谱扫描。

1.3.3数据库检索 通过Bioworks 3.3.1 SP1软件包用SEQUEST算法对有10个以上离子信号且强度在10个单位以上的谱图进行数据库检索。鉴定出相关多肽和蛋白质。

检索参数为：半胱氨酸修饰为+57，完全酶切肽段，可以有两个误切位点，多肽质量误差范围为3 Da。筛选参数为：①Rsp=1。②假阳性率为1%时，ΔCn≥0.19，多肽为单电荷时，Xcorr=2.2；多肽为双电荷时，Xcorr=2.5；多肽为三电荷时，Xcorr=2.9。

1.3.4免疫组化法检测大肠癌组织中PDIA3的表达情况 按试剂盒说明书操作。阴性对照用PBS缓冲液代替PDIA3一抗；已明确PDIA3蛋白阳性表达的切片作为阳性对照。采用奥林巴斯BX51显微成像系统对结果进行拍照。

2 结果

2.1大肠癌与癌旁组织的鉴定数据

经过对大肠癌组织总蛋白酶解多肽混合物进行检测分析，共获得696个蛋白质的鉴定材料；相应配对的癌旁组织共获得428个蛋白质的鉴定材料。

通过谱图数来评价每个蛋白质的丰度，将肿瘤组织与癌旁组织中蛋白谱图数的比值≥1，谱图数的差值≥72的蛋白鉴定为差异表达的蛋白。结果显示有显著差异表达的蛋白质共18个，其中大肠癌组织中表达上调的蛋白质共11个；在大肠癌组织中表达下调的蛋白质共7个。其中目标蛋白PDIA3为在大肠癌组织中上调表达的蛋白。

2.2免疫组化结果

为进一步研究PDIA3在组织中的表达情况及在细胞内的定位，我们采用了免疫组织化学方法进行研究。阳性结果的判定标准为：细胞内出现清晰棕黄色或棕褐色颗粒。如图1所示，PDIA3主要表达在胞浆，有的在胞浆和胞膜同时表达。

图1 PDIA3在大肠癌组织中的表达(╳200)

3 讨论

本研究运用二维色谱与质谱联用技术，分析鉴定了TNMⅢ期大肠癌及配对癌旁组织的蛋白表达情况，共得到了18个差异表达的蛋白质，这是从蛋白组学的层面对大肠癌进行研究，是近年来肿瘤研究方面一种较前沿的技术[7]。本研究得到了大量的组学数据，除本实验的目标蛋白外，还有许多数据值得在后续研究中深入分析，综合这些数据有望在筛选大肠癌的肿瘤标志物方面有所突破。

本实验的目标蛋白PDIA3在各种恶性肿瘤发生发展中的作用以及它的含量对肿瘤预后及治疗效果的影响也是近年来研究者们关注的热点。有研究发现PDIA3对肝癌细胞的增殖有重要的调节作用，并与肝癌的预后密切相关[8]。PDIA3可调节细胞的侵袭力，并作为宫颈癌的预后标志物[9,10]。PDIA3的表达还影响胃癌的预后[11]。PDIA3还可通过调节STAT3活性影响喉癌细胞对放疗的抗性，并作为喉癌的预后指标[12]。肿瘤细胞中PDIA3的消耗还将抑制其增殖并增加对电离辐射和化疗药的敏感性，因此，PDIA3将有望成为新的抗癌治疗靶点[13]。此外，PDIA3对大肠癌生物学行为的影响以及是否有望成为一种新的大肠癌的肿瘤标志物仍需我们在后续工作中深入研究。

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