肿瘤免疫微环境相关因子FOXP3在乳腺癌中的表达及临床病理分析

宫国良，陈静宁，张元鑫，吴盛桂

(1.汕头潮南民生医院 病理科，广东 汕头515044；2.汕头大学医学院第一附属医院 病理科；3.汕头市金平区妇幼保健院 妇产科)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，目前临床多采用手术、放疗、化疗、内分泌治疗、免疫治疗等联合治疗方法。其中，免疫治疗是近年来研究的热点，是继手术、放化疗和靶向治疗之后新兴且前景远大的治疗方法，肿瘤的免疫微环境作为免疫治疗的核心理论，尤其受到重视，但机制尚不十分清楚[1]。叉头状/翼状螺旋转录因子(FOXP3)是肿瘤免疫微环境标志性因子，广泛用于肿瘤免疫微环境的相关研究[2，3]。因此，本研究选取乳腺癌为研究对象，选择免疫微环境标志性因子FOXP3及与其表达密切相关的CD8、转化生长因子-β1(TGF-β1)三种抗体，探讨FOXP3与患者年龄、肿瘤大小、转移情况、分子分型及中医证型等临床病理特征的关系，并对FOXP3、 CD8及 TGF-β1三者的表达进行相关性分析，旨在进一步明确肿瘤免疫微环境与乳腺癌临床病理特征间的密切联系，及其各因子间的调控机制，为乳腺癌的免疫治疗提供新的思路及理论依据。

1 材料与方法

1.1材料收集汕头潮南民生医院2014年3月-2017年1月手术治疗的乳腺浸润性导管癌病例82例，手术前均未接受过抗癌治疗。患者均为女性，年龄分布31-66岁，平均48.5±17.5岁，所有患者均进行术前中医辨证分型。术后标本精确测量肿瘤最大直径后石蜡包埋，4 μm切片，苏木素-伊红染色，并常规进行了PR、ER、HER-2及Ki-67免疫组织化学染色，进行分子分型。

1.2方法标本经10%中性缓冲福尔马林固定，常规石蜡包埋、切片及染色。免疫组化采用EnVision两步法，FOXP3多克隆抗体购自英国Abcam公司，CD8(克隆号：C8/144B)单克隆抗体及TGF-β1多克隆抗体均购自福州迈新生物技术开发有限公司。组织切片65℃烤片后脱蜡至水，3%H2O2室温孵育10 min，蒸馏水洗，PBS冲洗5 min×3，滴加—抗室温孵育1.5 h，PBS冲洗5 min×3，滴加二抗，室温孵育15 min，PBS冲洗5 min×3，DAB显色，镜下控制阳性细胞呈棕色为止，充分蒸馏水洗，苏木素复染1分钟，脱水，封片。免疫组化均设阳性对照及阴性对照。FOXP3主要表达于细胞浆，CD8表达于细胞膜，TGF-β1表达于细胞浆。

2 结果

2.1FOXP3在乳腺癌中的表达情况FOXP3以细胞浆内出现黄色或棕黄色颗粒为阳性表达(图1)，FOXP3在乳腺癌中最常见的表达部位为细胞浆，其次为细胞浆与细胞核共同表达， 最少见的表达模式是细胞核表达，因此选取阳性表达部位的不同，实验结论差异较大。我们选取最常见的细胞浆表达模式作为观察统计的重点。结果采用半定量计分方法， 阳性细胞数按无着色、 阳性细胞数≤20%、21%-50%和>50%分别判为0、1、2、3分，着色强度按细胞浆无着色、浅黄色、深黄色和棕黄色分别判为0、1、2、3分。两项评分结果相乘>6视为高表达，<6分为低表达。我们检测的82个乳腺浸润性导管癌病例中，80例出现细胞浆阳性表达，仅2例阴性，按照高表达和低表达情况分为两组，其中高表达组50例(60.98%)，低表达32例(39.02%)。

2.2FOXP3的表达与乳腺浸润性导管癌临床病理特征的关系FOXP3的表达与淋巴结转移、分子分型有关， 与患者年龄、肿瘤直径及中医证型无关 (表1)。

表1 FOXP3的表达与乳腺癌临床病理特征的关系

2.3CD8在乳腺癌中的表达及其与FOXP3相关性分析本研究计数肿瘤间质中CD8阳性细胞的浸润密度，肿瘤间质CD8阳性细胞指肿瘤浸润边界以内的间质中未与癌细胞直接接触的淋巴细胞(图2)。低倍镜下选取淋巴细胞最丰富的区域5个，高倍视野下对该区域CD8阳性淋巴细胞进行计数。结果以5个视野细胞平均值表示CD8阳性细胞的浸润密度。在本研究中CD8阳性细胞的浸润密度为50.34±31.64个/HPF，与FOXP3的相关性分析显示，两者呈负相关，r=-0.225，P<0.001。

2.4TGF-β1在乳腺癌各中医证型中的表达情况及其与FOXP3相关性分析TGF-β1主要表达于癌组织细胞浆(图3)，按无着色、阳性细胞数≤20%、21%-50%和>50%分别判为阴性、+、++、+++。相关性分析显示，FOXP3与TGF-β1无明显相关性，r=0.113，P=0.317。

图1乳腺癌组织FOXP3细胞浆阳性表达EnVision法高倍放大图2CD8在肿瘤间质淋巴细胞中出现强阳性表达EnVision法高倍放大图3TGF-β1癌组织细胞浆阳性表达EnVision法高倍放大

3 讨论

1889年学者提出“种子和土壤”的假说，将肿瘤细胞比作种子,把肿瘤细胞所处的环境比作土壤,也就是我们说的肿瘤微环境。肿瘤微环境是由非肿瘤基质细胞构成，包括成纤维细胞、免疫细胞、内皮细胞等共同构成的关系到肿瘤发生、发展和转移的局部稳态环境[4,5]。而肿瘤微环境中的免疫细胞又构成了免疫微环境，免疫微环境作为肿瘤微环境有机整体的重要组成部分发挥着监视和防御作用[6,7]，是肿瘤与免疫系统正式交锋的地点。免疫微环境可以直接影响肿瘤的预后，在多种恶性肿瘤中发挥着重要作用，其中也包括乳腺癌，在乳腺癌中，免疫微环境既有积极的免疫监视和防御作用，亦有促进肿瘤生长、侵袭的作用，出现这些现象的具体机制尚不十分清楚，这也是研究者们关注的重点。

FOXP3是肿瘤免疫微环境标志性因子，广泛用于肿瘤免疫微环境机制研究。FOXP3是叉头样转录因子家族中的成员，2001年由Bmnkow等首次报道，早期研究发现，FOXP3特异地表达在CD4+CD25+调节性T细胞，与其发育和功能密切相关，随后学者们发现FOXP3在很多恶性肿瘤的癌细胞中也有表达，并且与这些恶性肿瘤的预后有着密切关系[8-10]。

有关FOXP3与乳腺癌的关系，也有少量文献报道，大都认为FOXP3与乳腺癌的不良预后有关。研究者选用免疫组织化学染色，来观察FOXP3在癌细胞中的表达，与乳腺癌各临床病理特征的关系，结果不完全一致，这和所选不同厂家的FOXP3抗体及观察的免疫组化阳性表达模式有关。在乳腺癌组织中，FOXP3以细胞浆阳性最多见， 其次为细胞浆与细胞核均表达， 最少见的表达模式是仅细胞核表达，因此，选择不同的阳性部位进行观察，对结果影响较大，甚至是完全相反的结论。本文选择最常见的细胞浆阳性模式，通过研究我们发现，乳腺癌组织FOXP3的表达与淋巴结转移、分子分型有密切关系，与患者年龄、肿瘤直径及中医证型无关。乳腺癌实质FOXP3蛋白表达与淋巴转移密切相关，在FOXP3高表达组中，淋巴结转移率为56%，而FOXP3低表达组中，淋巴结转移率仅为25%，两者存在显著差异，提示FOXP3在乳腺癌淋巴结转移中发挥作用，其作用机制可能为FOXP3抑制体内免疫微环境的抗肿瘤效应，使乳腺癌细胞发生肿瘤逃逸，从而促进了肿瘤浸润进展和转移。

同时，我们对FOXP3的表达与乳腺癌分子分型的关系做了进一步分析，我们发现在LuminalA组中，FOXP3的高表达率最高。李静平等[11]对FOXP3细胞核阳性、细胞质阳性与乳腺癌分子分型的关系分别作了统计， 在LuminalA型乳腺癌组织中，FOXP3细胞核表达率最高，而三阴型乳腺癌中细胞质FOXP3表达率最高，并认为FOXP3在乳腺癌细胞核中的表达，发挥改善乳腺癌预后的作用，而细胞质表达与预后不良相关，国外也有类似的研究结果[12]。这一结论与我们得出的结论不太一致，原因除了和所选的抗体及免疫组化条件有关外，可能还有较复杂的机制，乳腺癌肿瘤免疫微环境对分子分型的影响，不能简单的分析为仅受几个因子的影响，还需要较深入的研究。

FOXP3的阳性表达，在不同肿瘤直径及不同年龄组中无明显差异。本文首次对FOXP3的表达与乳腺癌中医证型的关系进行了分析，结果两者无明显相关性，但不同中医证型组乳腺癌CD8与TGF-β1存在明显差异性表达，说明中医证型和肿瘤免疫微环境还是有密切关系。

在肿瘤免疫微环境中，CD8和TGF-β1也是两个重要的因子[13，14]。而且CD8和TGF-β1与FOXP3在理论上有着密切关系，CD8+T细胞是肿瘤免疫微环境中最重要的效应执行细胞，抑制其活性，能够有效影响机体的免疫防御功能。FOXP3可以抑制或杀伤CD8+T细胞，达到肿瘤细胞免疫逃逸的目的，我们的实验结果也证实了该理论。在本研究中CD8阳性细胞的浸润密度与FOXP3表达的相关性分析显示，两者呈现负相关，r=-0.225，P<0.001，也就是说FOXP3可以抑制或杀伤CD8+T细胞的作用是明确的，其理论机制有两种可能性，其一为FOXP3直接抑制或杀伤CD8+T细胞，其二为FOXP3通过调控TGF-β1间接抑制或杀伤CD8+T细胞，因此我们又对FOXP3与TGF-β1的相关性做了分析，发现两者无明显相关性，因此，我们认为，FOXP3是直接抑制或杀伤CD8+T细胞，达到调控免疫微环境的作用，从而促使了肿瘤细胞的免疫逃逸。

综上所述，肿瘤免疫微环境标志性因子FOXP3表达于乳腺癌，并通过直接抑制或杀伤CD8+T细胞发挥作用,从而说明肿瘤免疫微环境与乳腺癌的密切关系，为乳腺癌的免疫治疗提供新的思路及理论依据。

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