IL-21/BCL-6/Blimp-1在囊性包虫病中的表达特点研究①

耿新惠 张峰波 姜 敏 赵 慧 安梦婷 庞楠楠 王红英 丁剑冰

(新疆医科大学第二附属医院检验科，乌鲁木齐 830063)

包虫病(Echinococcosis)，又称棘球蚴病，是细粒棘球绦虫的幼虫感染人体所致的疾病。牧区较多见[1]，包虫感染后，参与机体免疫反应的因子有很多，以往我们研究过Th1细胞相关因子、Th2细胞相关因子、Th17细胞相关因子和Treg细胞，一般以Th1/Th2细胞的失衡来评价感染状况[2-4]。目前认为CD4+T细胞新亚群、滤泡辅助性T细胞 (Follicular helper T Tfh)可通过调节B细胞介导体液免疫反应，辅助B细胞占主导地位的T细胞亚群[5,6]。据文献报道，Tfh及其相关分子同样参与寄生虫感染后体液免疫应答[7]。调节Tfh细胞的辅助因子有很多。白介素-21(Interleukin-21，IL-21)主要由Tfh细胞分泌，除了作为刺激B细胞的“辅助细胞因子”外,还是Tfh自分泌细胞因子。IL-21参与了自身免疫病和免疫缺陷的发病机制,并在丝虫病、疟疾及利什曼病的相关研究中也发现了一定作用。很可能成为治疗这些疾病的重要靶分子。B细胞淋巴瘤分子6(B cell lymphoma 6，BCL-6)是调控初始 T 细胞发育为 Tfh 细胞所必需的，且是 Tfh 细胞分化的充分必要条件[8]，其表达增高有利于 Tfh 细胞相关分子的表达，B淋巴细胞诱导成熟蛋白1(B lymphocyte-induced maturation protein-1，Blimp-1)是 B 淋巴细胞终极分化的主要调控子，是 Tfh 细胞的关键抑制因子，Blimp-1 的表达能阻止BCL-6 的表达和 Tfh 细胞的分化，并不会抑制Th1、Th2、Th17、Treg 等其他CD4+T 细胞的分化。这3种因子的表达变化在一定程度上反映了 Tfh细胞免疫应答状态[9,10]。BCL-6 通过与抑制性转录因子Blimp-1 的相互作用改变初始 CD4+T 细胞在Tfh细胞与Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、Treg细胞间的转换，调节机体免疫平衡，参与多种感染性疾病的发生。但是这3种因子在包虫病感染中的作用目前尚不清楚。因此，本次研究采用ELISA和RT-PCR法对CE患者血浆中IL-21水平及外周血单个核细胞(PBMC)中IL-21 mRNA、BCL-6 mRNA、Blimp-1 mRNA进行检测，探讨这几种因子在CE病程中的变化特点，为CE的病因分析和临床治疗提供实验基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象 收集2016年6～12月新疆医科大学第一附属医院住院确诊的CE患者27例，全部为肝脏感染病例，处于活动期，年龄在20～55岁之间，排除具有自身免疫性疾病患者。以30名健康体检者作为对照组。对照组要求无肝病，无自身免疫性疾病，近期无感染。影像学未检出包虫特殊影像。手术治疗组，追踪17例行手术摘除包囊患者，术后3个月复查影像学和血清学，均为阴性者收纳为治疗后组。所有受试者要求早晨空腹抽取外周静脉血约9 ml，一部分以EDTA抗凝，无溶血。一部分无抗凝，用于分离血清。

1.1.2试剂与仪器 ELISA试剂盒购自上海生工生物工程技术有限公司；RT-PCR 试剂盒购自德国Qiagen公司；Trizol 试剂购自美国Invitrogen公司；目的基因及内参引物均由上海生物工程技术有限公司合成。

1.2方法

1.2.1标本采集 肝包虫病患者入院后于次日清晨空腹抽取EDTA抗凝血约5 ml，用于分离外周血单个核细胞(PBMC)并从中提取总RNA 。同时抽取4 ml未抗凝血，离心取血清，于-70℃保存用于检测IL-21。

1.2.2ELISA法检测血清中IL-21浓度 取出冷冻血清，复溶至室温。严格按照试剂盒操作步骤进行。酶标仪波长设置为450 nm，读吸光度(OD)值，根据标准曲线计算 IL-21 的浓度值。

1.2.3实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测CE患者及健康对照外周单个核细胞中Blimp-1/BCL-6/IL-21 mRNA 表达情况 按照试剂盒说明提取总RNA后用核酸蛋白分析仪测定其纯度，确定是否达到反转录要求，将合格标本逆转录合成 cDNA。实时荧光定量PCR反应条件为：预变性95℃ 10 min，95℃ 15 s，59℃ 1 min ，40 个循环。计算 CE 组和健康组患者三种 mRNA 表达量，重复3 次取平均值。结果分析 ：采用2-ΔΔCT相对定量法，测定特定荧光域值对应循环数的CT值 ，对目标基因进行定量分析。

引物设计和合成:从 Gene Bank中检索人IL-21、BCL-6、Blimp-1 mRNA 基因引物序列，用 DNAMAN 软件设计引物 ，引物由上海生工生物公司合成，见表1。

1.3统计学处理 所有数据应用SPSS17.0统计软件处理，分析采用成组t检验，结果以P值表示，指标间相关性用Pearson相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1qRT-PCR法检测 Blimp-1、IL-21和BCL-6mRNA表达量

表1引物列表

Tab.1Listofprimers

PrimersSequence(5′to3′)IL⁃21＿FACACAGACTAACATGCCCTTCAIL⁃21＿RACCGTGAGTAACTAAGAAGCAAATCBCL⁃6＿FGGAAACCCAGTCAGAGTATTCGBCL⁃6＿RCACATTTGTAGGGCTTTTCTCCBlimp⁃1＿FTCCAGCACTGTGAGGTTTCABlimp⁃1＿RTCAAACTCAGCCTCTGTCCA

2.1.1CE组和健康对照组的mRNA表达水平 利用qRT-PCR检测PBMC中相关因子表达，结果显示，CE组BCL-6 mRNA表达水平升高，是对照组的39.8倍，差异有统计学意义(P<0.01)。IL-21 mRNA表达水平升高，是对照组的10.1倍,差异有统计学意义(P<0.01)。 但是 Blimp-1 mRNA在人感染棘球蚴后体内表达水平变化不明显(P>0.05)，无统计学意义，见表2。

2.1.2三种因子在CE患者治疗前和治疗后的mRNA表达水平 在CE患者中我们将最终跟踪到的17个治愈病例与治疗前患者Blimp-1/BCL-6/IL-21 mRNA结果相比较，三种因子的mRNA表达水平在手术治疗后均降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见表3。

2.2不同分组外周血IL-21水平的比较

2.2.1CE病例组和健康对照组中IL-21水平 利用 ELISA法检测CE组和健康组外周血清标本中IL-21水平，结果显示病例组IL-21表达量为(313.0±62.4)ng/L,而健康对照组表达量仅为(179.4±32.1)ng/L,两组差异有统计学意义(P<0.01)，见图1。

2.2.2CE患者治疗前后外周血IL-21水平 利用 ELISA法检测CE组治疗前后外周血清标本中IL-21水平，结果显示治疗前IL-21表达量为(352.6±37.7)ng/L,而健康对照组表达量仅为(176.4±27.7)ng/L,两组差异有统计学意义(P<0.01)，见图2。

表2两组IL-21BCL-6、BLIMP-1mRNA表达定量结果

Tab.2TwogroupsofIL-21/BCL-6/Blimp-1mRNAexpressionofquantitativeresults

GroupsnIL⁃21BCL⁃6Blimp⁃1Patients300 45±0 150 059±0 0960 05±0 02Healthy274 56±0 892 35±0 50 05±0 03t-25 23-24 99-0 126P<0 01<0 010 9

表3CE患者治疗前后两组IL-21、BCL-6、Blimp-1mRNA表达水平定量结果

Tab.3BeforeandaftertreatmentinCEpatientswithtwogroupsofIL-21/BCL-6/Blimp-1mRNAexpressionlevelofquantitativeresults

GroupsnIL⁃21BCL⁃6Blimp⁃1Beforetreatment174 58±0 82 48±0 570 048±0 028Aftertreatment170 96±0 360 61±0 380 039±0 023t13 59111 0823 194P<0 01<0 010 01

2.3相关性分析 将CE患者IL-21和Blimp-1、BCL-6 mRNA结果分别做Pearson直线相关性分析，如图3A～C显示IL-21与BCL-6的表达呈正相关(P<0.01)，IL-21与Blimp-1不相关(P=0.179)，并且BCL-6和Blimp-1的表达也不相关(P=0.157)，分析结果见图3。

图1 CE病例组和健康对照组中IL-21水平比较Fig.1 CE cases and healthy controls level of IL-21

图2 CE患者治疗前后IL-21水平比较Fig.2 CE IL-21 levels before and after treatment

图3 三种因子的相关性分析Fig.3 Correlation analysis of three factorsNote:A.IL-21 and BCL-6；B.IL-21 and Blimp-1；C.Blimp-1 and BCL-6.

3 讨论

肝包虫病是由细粒棘球绦虫的蚴虫侵入肝脏所致,在中国主要流行于畜牧业发达的新疆、青海、宁夏、甘肃、内蒙古和西藏等省区是牧区常见病。包虫囊肿在肝内逐渐长大，可发生感染、破裂播散及空腔脏器阻塞等并发症，严重影响当地的生产和生活。人感染细粒棘球蚴后，体内原有免疫系统平衡被打破，在与包虫对抗的过程中逐渐建立起新的平衡，因此免疫系统在对抗包虫病的发生和发展中起着非常重要的作用[11]。前期研究发现慢性细粒棘球蚴感染过程中发生了Th1/Th2免疫失衡现象,以往认为,Th2细胞通过分泌IL-4刺激B细胞增殖和Ig类别转换[12],上调B细胞CD40和MHCⅡ类分子的表达,是辅助B细胞的主要T细胞[13]。现在越来越多的研究倾向于Tfh是辅助B细胞的主要T细胞亚群[14],而Th1和Th2所分泌的细胞因子在B细胞活化和Ig类别转换中只起到调节作用[15]。参与肝包虫免疫病理的因子大多数为CD4+T 细胞、也有CD8+T 细胞、B细胞、浆细胞以及巨噬细胞[16,17]，其中CD4+T细胞主要为Tfh细胞，而Tfh细胞是T细胞分化和生存的重要信号[18]。IL-21是Tfh细胞分泌的主要细胞因子。能促进Tfh细胞的分化，调节B细胞和浆细胞分化，刺激免疫球蛋白的产生和类型转换，诱导BCL-6和Blimp-1的表达[19]。IL-21具有促炎作用，通过调节体液免疫参与肝包虫病的病程进展。在本次的研究中可以观察到CE患者感染棘球蚴的中晚期，在外周循环血中表达上调到基础水平的2倍左右，差异具有统计学意义。并在有效治疗后，下降到较低的水平，此水平与健康对照组基础水平基本一致。另外，我们做了IL-21和BCL-6及Blimp-1的相关性研究，在研究中发现IL-21与BCL-6呈正相关性。这与其他感染性疾病患者同样，BCL-6对Tfh细胞的表达有上调作用，而IL-21又是Tfh细胞的主要效应分子，由此我们可以推断出BCL-6、Tfh、IL-21是CE患者免疫反应中反馈调节的轴心[20]。同时，我们在IL-21与Blimp-1相关性研究中发现，他们之间无必然联系。Blimp-1能促进B细胞向浆细胞转换从而调节抗体的释放。据报道[21]，与其在B细胞中的功能不同,Blimp1可能并不是T细胞发挥抗寄生虫免疫的关键蛋白。Blimp1基因的表达常与T细胞反应不同步,即在T细胞受到抗原刺激后几天才能达到峰值[22]。我们在此次结果中观察到Tfh细胞的关键因子IL-21和Blimp-1产生量不一致的现象，有待于进一步研究。

BCL-6是Tfh 细胞的关键转录因子，可调控初始T细胞转化为Tfh细胞，进一步促进Tfh细胞表达趋化因子CXCR5，共刺分子ICOS[23]，进而与 B细胞相互作用，BCL-6高表达能促进Tfh细胞相关基因的表达并且抑制Th1、Th17细胞的分化。据报道，人感染蠕虫后，淋巴器官表达标记为CXCR5和ICOS 的CD4+滤泡辅助性T细胞，感染后的Tfh 细胞表达转录因子BCL-6，分泌细胞因子IL-21，还表达GATA3，这是Th2分化的转录因子[24]。在本研究中发现CE患者体内高表达BCL-6，说明与其他寄生虫感染一样，BCL-6的转录控制了T细胞的分化与分泌，与包虫感染过程密不可分。

研究发现，CD4+T细胞中的非Tfh细胞的细胞核中高表达Blimp-1[25]，与Tfh细胞的转录因子BCL-6具有相互拮抗作用[26]，同时B细胞中Blimp-1作为BCL-6的拮抗剂可抑制Tfh细胞分化，反之，BCL-6也抑制 Blimp-1表达，促进Tfh细胞分化。Tfh细胞数量和功能的异常使自身免疫失衡[27]，在本研究中发现BCL-6和Blimp-1在疾病的发展中同时都升高，但不成正相关性，就本病来说，CE患者临床分型也较多，此次试验未做临床分型评价，或许两者之间在更细的范围内有很好的相关性，这在以后的实验当中可以进一步研究。

综上所述，我们探讨了CE病患者血清中IL-21、外周单个核细胞中IL-21、Blimp-1和BCL-6的mRNA表达水平，并在研究中发现，Tfh细胞亚群的相关因子BCL-6、Blimp-1、IL-21在CE病程中均升高，并随治疗后明显下降，这表明三种因子可能参与了细粒棘球蚴感染人体的免疫病程，尤其是BCL-6在T细胞分化及产生相关效应因子IL-21的过程中起到主要调节作用。本研究还明确了Tfh及其相关因子参与肝包虫的发病机制。为研究包虫病治病机制拓宽了思路。

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