miR-194在增龄性胸腺萎缩中的表达及靶基因研究①

易丽君 祝漫琴 周 菁 胡清华 黄 慧 陈 卡 江志军 郭智彬

(江西省儿童医院中心实验室，南昌 330006)

胸腺作为中枢免疫器官的一种，是胸腺依赖性淋巴细胞(Thymus-dependent lymphocyte，简称T细胞)分化发育的场所[1，2]。随着我国老龄人口的不断增长，其健康水平受到越来越多的社会及政府关注。而老年人的免疫水平低下是老年病的重要诱因之一。特别是老年人胸腺的重量和结构发生显著萎缩，外周免疫器官中成熟T细胞数量显著降低，机体免疫功能受到严重影响。随着年龄的增加，胸腺重量和体积明显缩小，免疫功能减退的过程称为增龄性胸腺萎缩。胸腺由胸腺细胞与胸腺基质细胞组成。胸腺细胞是处于不同分化阶段的T细胞。胸腺基质细胞是胸腺微环境的主要成分，包括胸腺上皮细胞、树突状细胞、成纤维细胞与巨噬细胞。已有文献报道胸腺微环境中促进T淋巴细胞发育的主要是胸腺上皮细胞[3,4]。国内外公认的增龄性胸腺萎缩机理有两种：①胸腺细胞功能受损，数量减少，直接影响胸腺细胞分化与成熟。②胸腺上皮细胞的数量减少，功能缺失，破坏了胸腺细胞发育的胸腺微环境，间接影响胸腺细胞分化与成熟。本课题组前期研究结果支持后者。

miRNA是一种22 bp左右的非编码蛋白RNA，在真核细胞中miRNA通过结合特异序列影响相关靶基因的表达水平[5]。在胸腺的发育、衰老以及T细胞的成熟过程中已发现很多miRNA参与调节进程。如miR-181a，参与了胸腺细胞分化与发育过程等[6]。目前为止，关于miR-194在胸腺增龄萎缩过程中的作用机制尚无报道。本实验旨在通过检测不同年龄组胸腺上皮细胞中miR-194与相应靶基因表达水平并探讨二者关系，阐述增龄性胸腺萎缩过程中的调节机制。

1 材料与方法

1.1动物分组与细胞提取 24只健康无疾病且无特定病原体(Specific pathogen free,SPF)级C57BL/6小鼠，购自上海斯莱克实验动物有限公司，每只体质量25 g左右。中老龄小鼠均为自然老化。所有小鼠均在本实验中心饲养。小鼠按月龄分为4组：1月龄组、6月龄组、10月龄组和19月龄组，每组6只，雌雄各半。小鼠麻醉后，用眼科摄取出胸腺组织，置于无菌PBS液中，将胸腺囊膜轻轻撕裂并振荡，释放出T细胞。经过CD45抗体磁珠分选法获得胸腺上皮细胞。

1.2方法

1.2.1总RNA和反转录按照试剂盒说明书提取各组胸腺上皮细胞总RNA。紫外分光光度仪检测总RNA浓度及纯度，琼脂糖凝胶(1.5%)电泳检测总RNA是否完整。取0.5 μg总RNA，利用SYBRTMPrime Script RT-PCR kit反转录成cDNA。

1.2.2miRNA的提取、加尾与反转录参照miRNA 抽提试剂盒说明书提取各组胸腺细胞miRNA。核酸紫外分析仪检测miRNA浓度及纯度。参照Ecoli.Poly(A)聚合酶试剂盒将miRNA进行加尾。取0.5 μg加尾后的miRNA，利用SYBR Prime ScriptTMRT-PCR kit反转录成cDNA。反转录引物为：5-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATG-ACAGTG(T)24V-3′。

1.2.3实时荧光定量PCR反应 反应体积 20 μl(TaKaRa，Japan)：RNase Freed H2O 6 μl，2×SYBR PrimeScriptTM10 μl上下游引物2 μl，DNA模板(cDNA)2 μl，共计20 μl。在ABI7500中进行Real-time PCR反应。miR-194上游引物序列：CATTCAACGCTGTCGGTGAGT；下游引物序列：GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG。PTPN12上游引物序列：TCCTGAGGAGGTTCATCCAGA；下游引物序列：CAGTGGCTGTGGGATAAATCTT。GAPDH上游引物序列：AGGTCGGTGTGAACGGATTTG；下游引物序列：GGGGTCGTTGATGGCAACA。miRNA内参引物使用美国 Ambion公司U6 snRNA。

1.2.4蛋白质免疫印迹实验 从胸腺上皮细胞或OP9-DL1细胞中提取总蛋白并测定蛋白浓度。取总蛋白30 μg，经10%SDS/PAGE分离胶电泳后转膜，用5%脱脂牛奶封闭，室温静置2 h。再经过PTPN12抗体(1∶1 00)、β-actin抗体(1∶2 000)孵育，4℃过夜。然后TBST洗膜6次，5 min/次，加入辣根酶标记IgG(稀释)，室温孵育60 min，TBST洗二抗3次。最后加入化学发光显色液，暗室压片，显影和定影。使用Bio-Rad扫描仪扫描图像，并用Image Lab进行灰度值分析，将PTPN12与β-actin灰度值的比值作为蛋白的相对表达量。

1.2.5细胞的培养与转染 HEK293细胞购买自南昌乐悠生物有限公司，DMEM高糖(HyClone)，10%FBS(HyClone)，37℃、5%CO2，过夜培养。OP9-DL1获赠于中国医科大学附属盛京医院中心实验室，DMEM高糖(自配)，10%FBS(Gibco)，37℃、5%CO2，过夜培养。细胞转染：50 μl Opti-MEMI培养基稀释0.8～1.0 μg DNA，50 μl Opti-MEMI培养基稀释1 μl Lipofectamine 2000试剂。混合稀释的DNA和Lipofectamine 2000并直接将复合物加入到每孔细胞中，37℃、5%CO2培养箱孵育24 h或48 h。

1.2.6荧光素酶报告基因检测 为验证 PTPN12是否为miR-194的靶基因，将插入PTPN12基因3′UTR片段(野生型或突变型)的荧光素酶报告载体与 miR-194 mimics(或miR-194 inhibitor)共转染HEK293细胞中。所有荧光素酶报告载体、mimics与inhibitor均购自广州复能基因有限公司。分别于24 h、48 h后吸取细胞培养液。按试剂说明书稀释10倍GLS buffer母液至1倍工作液，避光室温孵育25 min。加10 μl培养液至96孔板中再加入GLS buffer工作液100 μl，孵育1 min。取40～50 μl培养液，65℃孵育10～15 min，置于冰上。SEAP buffer中加入SEAP底物，室温孵育5～10 min。加样至96孔板中，开始检测。

2 结果

2.1不同月龄组胸腺上皮细胞内PTPN12基因与miR-194表达水平 随着月龄增长，小鼠胸腺上皮细胞内miR-194呈现表达下降趋势(表1)，1月龄组与其他3组间均存在统计学差异(P<0.05)。其中19月龄组小鼠胸腺上皮细胞内miR-194表达下降趋势最显著，见图1A。而PTPN12基因mRNA表达水平则明显呈现上升趋势(表1)，1月龄与其他3组间均存在统计学差异(P<0.05)。其中19月龄组小鼠胸腺上皮细胞内 PTPN12表达上升趋势最显著，见图1B。

表1不同月龄小鼠胸腺上皮细胞内miR-194、PTPN12表达水平变化

Tab.1ExpressionofmiR-194andPTPN12inthymusepi-thelialcellsfromdifferentmonthsofmouse

与mRNA结果一致的是，PTPN12的蛋白表达水平也呈现上升趋势(表1)， 1月龄组与其他3组间均存在统计学差异(P<0.05)，见图1D、E。相关性分析结果显示，小鼠胸腺上皮细胞内miR-194与PTPN12基因mRNA表达水平呈负相关性(r=-0.80，P<0.05)，见图1C。

2.2荧光素酶报告基因实验 分别转染miR-194 mimics或 inhibitor 24 h后检测荧光值，详见表2。结果显示过表达miR-194 后，PTPN12基因3′UTR野生型组荧光值显著降低约50%，与突变组、空质粒组(NC)、乱序组均有统计学差异(P<0.05)。而PTPN12基因3′UTR位点突变后与miR-194的结合效率明显下降，与空白质粒组及Scramble 1组三组荧光值无统计学差异。该结果直接证实PTPN12基因是miR-194靶基因之一。

表2分别转染miR-194mimics或inhibitor24h后结果

Tab.2ResultoftransfectionofmiR-194mimicsorinhibi-torintocellsafter24h

GroupsmiR⁃194mimicsScramble1miR⁃194inhibitorScramble2PTPN12wildtype1 06±0 061 83±0 072 14±0 101 80±0 05PTPN12mutanttype1 83±0 041 96±0 072 03±0 051 88±0 04Negativecontrol2 08±0 011 95±0 071 94±0 061 89±0 06

图1 miR-194与PTPN12基因的表达水平及相关性分析Fig.1 Expression level and correlation analysis of miR-194 and PTPN12 geneNote:A.miR-194 expression level;B.PTPN12 mRNA expression level;C.Correlation analysis between miR-194 and PTPN12 mRNA expression;D.PTPN12 protein expression level(Western blot);E.PTPN12 protein expression level (statistics).

表3分别转染miR-194mimics或inhibitor48h后结果

Tab.3ResultoftransfectionofmiR-194mimicsorinhi-bitorintocellsafter48h

GroupsmiR⁃194mimicsScramble1miR⁃194inhibitorScramble2PTPN12wild1 22±0 132 66±0 153 02±0 212 76±0 14PTPN12mutants2 74±0 262 85±0 222 88±0 163 01±0 20Negativecontrol2 97±0 212 96±0 183 00±0 202 91±0 20

表4转染miR-194mimic48h后检测PTPN12表达水平

Tab.4ExpressionlevelofPTPN12withmiR-194mimictransfectionintocellsafter48h

GroupsmiR⁃194PTPN12mRNAPTPN12proteinNegativecontrol1 06±0 161 08±0 131 13±0 18Scramble10 98±0 121 15±0 161 12±0 11miR⁃194mimics2 78±0 330 40±0 090 48±0 13

图2 转染miR-194 mimic 48 h后PTPN12基因的表达水平及相关性分析Fig.2 Expression level and correlation analysis of miR-194 and PTPN12 with miR-194 mimic transfection into cells after 48 hNote:A.miR-194 and PTPN12 mRNA expression level;B.PTPN12 protein expression level (Western blot);C.PTPN12 protein expression level (statistics).

结果还显示沉默miR-194 后，PTPN12基因3′UTR野生型组荧光值比突变组稍高，虽无统计学意义，但说明少量内源性miR-194对PTPN12基因3′UTR有影响，间接证实PTPN12基因是miR-194靶基因之一。

再次观察转染miR-194 mimics或 inhibitor 48 h后的荧光值，详见表3。结果与24 h相似，但共转染miR-194 与PTPN12基因3′UTR野生型组荧光值降低约60%，比24 h下降程度更明显，因此观察时间上48 h比24 h更合适，二者结合效率更高。该结果同样直接证实PTPN12基因是miR-194靶基因之一。

2.3过表达miR-194后，细胞内PTPN12基因表达水平变化 取指数生长期的OP9-DL1细胞，转染miR-194 mimic，48 h后检测PTPN12表达水平变化。结果(表4)显示：转染Scramble1组与未转染组(NC)之间miR-194表达水平无统计学差异，而转染miR-194 mimics组比其他两组miR-194表达水平明显升高且有统计学差异，说明转染成功。而过表达miR-194的OP9-DL1细胞内PTPN12基因的mRNA与蛋白水平显著下降(图2)，说明miR-194确实影响了PTPN12基因的表达水平。再次证实PTPN12基因是miR-194靶基因之一。

3 讨论

人体免疫系统是由相应的免疫器官、组织、细胞及分子构成。免疫器官包括中枢与外周免疫器官。骨髓作为中枢免疫器官之一，是所有免疫细胞的产生地，也是B细胞发育的场所。胸腺则是T细胞分化发育的场所。

近年来越来越多的研究发现，增龄性胸腺萎缩是老年人机体免疫功能下降的主要原因之一，但其分子机制尚不明确。目前，国内外公认的增龄性胸腺萎缩机制假说有两种：①T淋巴祖细胞本身功能受损，数量减少，导致胸腺发生萎缩。②胸腺上皮细胞数量减少，功能退化，数量减少，T细胞的发育微环境被破坏，影响T细胞的分化与成熟。本研究认为后者是主要原因。国内外已有文献报道参与胸腺发育与衰老的基因，如Foxn1、Hoxa3、Wnt4等[7]。在增龄性胸腺萎缩过程中，这些基因与miRNA构成了非常复杂的调节网络并发挥作用。

miRNA是一种22 bp左右的非编码蛋白RNA，它的前体中包含发夹结构。Dicer酶将miRNA前体剪切成为成熟的miRNA序列，参与到RISC复合体中起降解mRNA或阻断mRNA翻译的过程。

本课题组在前期研究工作中将不同年龄组小鼠胸腺上皮细胞进行miRNA表达谱筛选，并进行了Real-time PCR验证。实验结果发现了与增龄性胸腺萎缩密切相关的20种miRNA[8]。其中，miR-194是随年龄增长，胸腺上皮细胞中表达差异非常明显的miRNA之一。而miR-194的靶基因鉴定及基因功能等后续研究工作尚未展开。已有文献报道，miR-194靶基因有很多，且作用机制各异。如miR-194通过下调STAT1促进成骨细胞分化[9]，或靶定RBX1调节胃癌细胞的增殖与迁移[10]，或靶定细胞骨架蛋白talin2抑制了肿瘤细胞的迁移[11]等。Khella等[12]还发现在肾细胞癌中miR-194靶定ZEB2、MDM2抑制肿瘤发生、发展。Wu等[13]在肺癌中发现，miR-194靶定BMP1和p27来调控TGF-β信号通路，进而下调MMP2和MMP9基因。Zhai等[14]发现在子宫内膜癌患者中，miR-194高表达的患者预后较好。然而，Zhang等[15]在小鼠胰管癌中发现miR-194靶定DACH1促进肿瘤细胞的增殖与侵袭，是一种肿瘤促进因子。Iizuka等[16]也认为miR-194靶定NUDC和DEPDC1B基因促进乳腺癌细胞的增殖。目前已发现的miR-194靶基因还有Tcf1、ACVR2B、Sox5等[17-19]。由此可见，在肿瘤学中miR-194的靶基因及相关调控机制研究较多。但在免疫学，特别是增龄性胸腺萎缩发生、发展过程中miR-194的靶基因及调控的下游信号通路尚未发现，其分子调节机制尚不明确。

在本课题组前期研究工作中，通过microRNA靶基因预测数据库预测到miR-194的靶基因有：PTPN12、Hbegf和Sumo2。PTPN12，1993年被首次克隆出来，是一种非跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶[20]。2004年Hasegawa等[21]发现PTPN12基因调节T细胞发育与分化，影响效应/记忆T细胞的功能，参与免疫反应。最近的研究发现PTPN12与AKT通路或NF-kappaB通路相关，影响T细胞受体的先天性免疫[22-24]。目前为止，PTPN12的细胞生物学功能主要是抑制细胞增殖或促进细胞凋亡，但是肿瘤学功能尚不明确。虽然在大部分肿瘤研究中普遍认为PTPN12是一种肿瘤抑制基因，抑制肿瘤细胞的增殖与迁移或者被甲基化沉默[25,26]。但是Harris等[27]却发现在乳腺癌中PTPN12是一种肿瘤促进因子，与FOXO信号通路有关。综上所述，PTPN12是增龄性胸腺萎缩研究中miR-194未知的靶基因之一。

本次实验结果显示，随着年龄增长，小鼠胸腺上皮细胞内PTPN12 基因表达明显呈现上升趋势，与 miR-194 的表达水平呈负相关。通过荧光素酶实验证实miR-194 的靶基因之一是PTPN12，并通过多组对照反向证实该结果。在细胞中改变miR-194表达水平时，PTPN12表达水平亦发生相应变化。表明 miR-194 有极大可能是通过靶向调节 PTPN12 基因，参与增龄性胸腺萎缩过程，为研究增龄性胸腺萎缩的分子机制提供新的研究方向。综上所述，PTPN12是miR-194的靶基因之一，有极大可能调控胸腺上皮细胞功能，参与增龄性胸腺萎缩过程。为进一步阐明增龄性胸腺萎缩过程中的基因调节机制，也为提高老年人健康生活水平提供坚实的理论基础和科学依据。

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