TET1在肝癌组织中的表达及对HepG2细胞生物学行为的影响

王传旭，刘传亮，史光军

(1潍坊医学院，山东潍坊 261053；2青岛大学医学院;3青岛市立医院)

肝癌是世界范围内第五大最常见恶性肿瘤，也是癌症相关性死亡的第二大原因，并且其发病率持续升高。虽然在过去十几年中，其治疗水平有相当大提高，但是肝癌患者的总生存期却没有明显提高[1]。因此，探究肝癌发生发展的分子基础，寻找建立有效的监控和治疗靶点是现今最重要的研究方向。肿瘤生长和癌症侵袭普遍受表观遗传学方式的调控，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA以及染色体结构改变。异常的DNA甲基化被证实参与肿瘤的发生发展以及化疗药物的抵抗[2]。TET家族是一种甲基胞嘧啶加双氧酶，其中包含TET1、TET2、TET3。TETs可以催化DNA的脱甲基化，主要通过催化5-甲基胞嘧啶(5-mC)转变成5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)。其中，在癌症进展中TET1是最主要和研究最多的[3]。有研究发现，TET1促进基因重排相关的恶性肿瘤发生，如MLL型白血病[4]；在胃癌、肺癌中则发挥抑制肿瘤的作用[5]。2017年6月～2018年2月，本研究探讨了TET1在肝癌中的表达变化以及在肝癌发病过程中发挥的生物学作用。

1 材料与方法

1.1 材料 组织:肝癌组织及癌旁组织(距离癌组织2 cm)标本切片38例份由潍坊医学院病理科提供。其中，患者男33例、女5例，年龄44～59岁、平均49.2岁，术前均未行放化疗及靶向药物治疗。细胞:人肝癌HepG2细胞株由青岛市立医院肝胆胰细胞实验室惠赠；试剂及仪器：DMEM培养基、胎牛血清、胰酶、PBS购自Gibico公司；TET1抗体、GAPDH抗体、HRP二抗购自Sigma公司；SDS-凝胶配制试剂盒、RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂和PVDF膜购自上海碧云天生物技术有限公司；CCK-8试剂盒购自日本DoJINDO公司；TET1过表达质粒和过表达空载质粒购自南通思特康生物科技有限公司。

1.2 肝癌组织及癌旁组织中TET1蛋白表达的检测 ①采用免疫组化SP法。组织脱蜡后递减浓度乙醇复水，PBS洗片，30%过氧化氢溶液孵片10 min，蒸馏水洗3次，然后进行抗原修复，PBS洗片，羊血清室温封闭30 min，TET1抗体(1∶2 000稀释)4 ℃孵育过夜。PBS洗片后加入二抗，20 ℃、20 min，PBS洗片，DAB显色，苏木精复燃，脱水，中性树胶封片，镜检。TET1蛋白在组织中主要表达在细胞核中，呈棕黄色颗粒。使用Remmele等提出的免疫反应积分评分法对染色后的切片进行评分。根据阳性细胞数和着色深度计分，每例随机观察计数5个高倍视野(×400)，计算每个视野的阳性率，取平均数，并按下列计分：阳性细胞≤5%为0分，>5%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%～75%为3分，>75%为4分。着色深度：阴性结果0分，淡黄色染色1分，淡棕色染色2分，棕色染色3分。取两者乘积作为总分进行分析，≥1为阳性，<1为阴性。②采用蛋白质印迹法：取低温保存的肝癌及癌旁组织30 mg，用含有蛋白酶抑制剂的裂解液提取总蛋白，BCA法测蛋白浓度。取等量蛋白样品(40 μg)进行电泳，并转移至PVDF膜上。用含有5%脱脂奶粉室温封闭2 h，弃去封闭液，分别加入用5% BSA的PBS稀释的一抗(TET1 1∶200；β-actin 1∶2 000)，4 ℃摇床过夜。一抗孵育结束后，TBST洗涤，用HRP标记的山羊抗鼠IgG(1∶2 000)室温孵2 h，TBST充分洗涤后，电化学发光显影。采用Image-Pro Plus 6.0软件分析条带灰度值，将TET1条带与作为内参的β-actin条带灰度值的比值作为蛋白相对表达量。

1.3 肝癌及癌旁组织中TET1 mRNA表达的检测 采用RT-PCR法。取低温保存的肝癌及癌旁组织100 mg置于1.5 mL的去RNA酶EP管中，加入检测TRIzol 1 mL。按照TRIzol试剂盒的说明书提取总RNA，用紫外分光光度仪对提取的总RNA计算纯度和浓度后，将提取的RNA按照逆转录试剂盒(日本TAKARA公司)的说明书进行逆转录处理，反应体系为：总RNA 400 ng、 PrimeScript RT Master Mix 2 μL及RNase Free dH2O共10 μL，37 ℃、15 min，85 ℃、5 s；PCR引物由北京赛百胜基因技术有限公司合成，以GAPDH为内参照，定量PCR扩增在罗氏定量PCR仪上进行。反应完成后计算机自动输出cDNA模板的扩增曲线及循环阈值(Ct值)，采用2-ΔΔCt法处理数据。TET1 mRNA的表达水平检测均采用GAPDH作为内参基因，来校正被测样品中mRNA水平，用TET1 mRNA与各自的GAPDH的差值来表明样本中目的基因mRNA的表达水平。

1.4 细胞培养与转染 HepG2细胞系用DMEM培养基(含10%胎牛血清，1%青-链霉素)培养，于含5% CO2培养箱中37 ℃恒温培养，1%胰酶消化传代。转染前接种于6孔板预先培养24 h，分别加入TET1基因过表达重组慢病毒颗粒和空载体对照慢病毒颗粒进行转染，转染5 h后更换完全培养液，24 h后换液，转染后72 h开始添加2 μg/mL嘌呤毒素，通过梯度实验筛选稳定转染细胞，筛选1周。成功构建的TET1过表达(过表达组)及空载体HepG2细胞(对照组)冻存于液氮中，进行实验时复苏细胞后对TET1表达情况进行重新鉴定。

1.5 HepG2细胞增殖能力检测 采用CCK-8法。取两组细胞，以0.25%胰酶消化，分别制成1.5×104/mL的细胞悬液，接种于96孔板中，每组设6个复孔，每孔细胞悬液100 μL，铺六孔板。培养0、24、48、72、96、120 h后，每孔加CCK-8溶液10 μL置于37 ℃、5% CO2的培养箱继续培养2 h，用酶标仪测波长450 nm处各孔的OD值，每组去掉最大值和最小值，取平均值。

1.6 HepG2细胞迁移能力检测 采用划痕试验。在六孔板底面预先绘制数条参考线，用于定位划痕位置。将两组细胞(5×105/孔)分别接种在6孔板，每组设3个平行孔，培养24 h后，使用200 μL枪头进行划痕处理，PBS洗涤2次，将细胞在无血清培养基中培养。使用装有数码相机(德国Zeiss公司)的倒置显微镜，观察并拍摄0 h及24 h划痕照片，使用Image Pro Plus6.0软件读取划痕面积，平均相对迁移距离=0 h划痕面积/高度-24 h划痕面积/高度，划痕愈合率=(0 h划痕面积-24 h划痕面积)/0 h划痕面积×100%。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 肝癌组织及癌旁组织中TET1的表达比较 38例肝癌组织中TET1阳性表达9例(23.7%)，癌旁组织中TET1阳性表达27例(71.1%)，两者TET1阳性表达率比较，χ2=17.100，P<0.01。肝癌组织和癌旁组织中TET1蛋白相对表达量分别为0.46±0.09、1.15±0.13,两者比较，P<0.05。RT-PCR结果显示，以TET1 mRNA在癌旁组织中表达量平均值为1，肝癌组织为0.43±0.07,两者比较，P<0.05。

2.2 两组增殖能力比较 培养0、24、48、72、96、120 h，过表达组OD值分别为0.212±0.004、0.228±0.005、0.301±0.007、0.393±0.006、0.432±0.007、0.582±0.012；对照组分别为0.211±0.002、0.246±0.003、0.347±0.006、0.541±0.008、0.685±0.007、0.897±0.009。在培养24、48、72、96、120 h时过表达组的OD值均低于对照组(P均<0.05)。

2.3 两组迁移能力比较 过表达组相对迁移距离为(0.47±0.007)μm，划痕愈合率为(14.38±1.67)%；对照组相对迁移距离为(0.94±0.08)μm，划痕愈合率为(28.15±2.61)%。与对照组比较，过表达组的相对迁移距离短和划痕愈合率低(P均<0.05)。

3 讨论

越来越多的证据显示，DNA甲基化状态的异常与肿瘤的进展和癌症患者的预后有密切关系。已有研究证实，DNA甲基化广泛参与肝癌的发病过程[6]。胞嘧啶甲基化会导致肿瘤抑制基因的沉默从而导致癌症形成。而DNA脱甲基化酶又会抵消这种致癌基因的作用。TET家族蛋白可以通过催化DNA的5-mC转化成5-hmC而促进DNA的脱甲基化[7]。根据一个对887例腺癌的Meta分析得出TET1 mRNA水平在肿瘤的第一阶段会下调[8]。另外，有研究证实TET1蛋白在前列腺癌和乳腺癌组织中的表达也会下调[9]，因此在本研究中，我们首先通过免疫组化法、蛋白质印迹法和实时定量PCR检验了肝癌组织和癌旁正常组织中TET1蛋白及mRNA表达的差异，结果显示TET1在肝癌组织中的表达降低，说明TET1可能参与了抑制肝癌的发生。

细胞侵袭是原发肿瘤生长和转移启动的关键步骤，因此肿瘤细胞的增殖及迁移能力直接代表了癌症的恶性程度。已有研究显示，TET1在胃癌、卵巢癌和乳腺癌发挥抑制肿瘤生长和侵袭的作用[7]。因此，我们采用构建过表达质粒并转染人肝癌细胞中，验证TET1的过表达对肝癌细胞的增殖和迁移能力的影响，结果提示TET1过表达可抑制肝癌细胞的恶性生物学行为。

金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)是一种基质金属蛋白酶(MMP)家族蛋白及其内生性的调控因子，它在细胞侵袭和上皮间质转化过程中发挥重要的调控作用[10,11]。例如，MMP2和MMP9会通过损坏细胞基底膜和降解Ⅳ型胶原蛋白和层黏连蛋白而促进细胞侵袭。虽然机制不清，但TIMP蛋白可通过结合MMPs的活性位点或降低MMPs活酶而抑制MMPs的活性[12]。TIMP基因已被证实受DNA甲基化的调控，且已有研究证实在某些肿瘤细胞中，TIMP正是TET1发挥抑制肿瘤作用的下游调控因子[13]。因此，TIMPs可以作为我们进一步研究TET1抑制肝癌发生发展的相关信号通路的一个较好目标。

综上所述，TET1蛋白在肝癌组织中的表达发生了下调，并且其基因的过表达会抑制肝癌细胞的增殖活性和迁移能力。说明TET1密切参与肝癌的发生发展过程中，因此，TET1可作为治疗肝癌的一个靶向基因。

参考文献：

[1] Trinchet JC. Hepatocellular carcinoma in 2014: current situation and future prospects[J]. Diagn Interv Imaging， 2014，95(7-8):705-708.

[2] Kelly AD, Issa JJ. The promise of epigenetic therapy: reprogramming the cancer epigenome[J]. Curr Opin Genet Dev， 2017，42:68-77.

[3] Ito S, Shen L, Dai Q, et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine[J]. Science， 2011，333(6047):1300-1303.

[4] Huang H, Jiang X, Li Z, et al. TET1 plays an essential oncogenic role in MLL-rearranged leukemia[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2013，110(29):11994-11999.

[5] Pei YF, Tao R, Li JF, et al. TET1 inhibits gastric cancer growth and metastasis by PTEN demethylation and re-expression[J]. Oncotarget， 2016，7(21):31322-31335.

[6] Tian YP, Zhu YM, Sun XH， et al. Multiple functions of ten-eleven translocation 1 during tumorigenesis[J]. Chin Med J (Engl)， 2016，129(14):1744-1751.

[7] Hsu CH, Peng KL, Kang ML, et al. TET1 suppresses cancer invasion by activating the tissue inhibitors of metalloproteinases[J]. Cell Rep， 2012，2(3):568-579.

[8] Yang H, Liu Y, Bai F, et al. Tumor development is associated with decrease of TET gene expression and 5-methylcytosine hydroxylation[J]. Oncogene， 2013，32(5):663-669.

[9] Neri F, Dettori D, Incarnato D, et al. TET1 is a tumour suppressor that inhibits colon cancer growth by derepressing inhibitors of the WNT pathway[J]. Oncogene， 2015，34(32):4168-4176.

[10] Bourboulia D, Stetler-Stevenson WG. Matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): positive and negative regulators in tumor cell adhesion[J]. Semin Cancer Biol， 2010，20(3):161-168.

[11] Friedl P, Alexander S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity[J]. Cell， 2011，147(5):992-1009.

[12] Zeng ZS, Cohen AM, Guillem JG. Loss of basement membrane type Ⅳ collagen is associated with increased expression of metalloproteinases 2 and 9 (MMP-2 and MMP-9) during human colorectal tumorigenesis[J]. Carcinogenesis， 1999，20(5):749-755.

[13] Chernov AV, Sounni NE, Remacle AG, et al. Epigenetic control of the invasion-promoting MT1-MMP/MMP-2/TIMP-2 axis in cancer cells[J]. J Biol Chem， 2009，284(19):12727-12734.