正交实验优化厚朴酚与和厚朴酚的提取工艺

张碧瑶，刘利根，石心红

(中国药科大学中药制剂教研室，南京 211198)

厚朴是木兰科植物凹叶厚朴MagnoliaofficinalisRehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.或厚朴MagnoliaofficinalisRehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮[1]。在湖北北部、陕西南部、四川、甘肃东南部、河南东南部和贵州东北部等地分布广泛，其中四川、湖北和安徽为较优质的产区[2]，其药用部位主要是树皮，其中根皮和干皮中厚朴酚与和厚朴酚含量最高[3]，主治痰饮喘咳、湿滞伤中、食积气滞和腹胀便秘[4]等症。厚朴的有效成分有厚朴酚、和厚朴酚、四氢厚朴酚、异厚朴酚、厚朴醛、丁香脂素和厚朴木脂素等[5]，其中主要的有效活性成分是厚朴酚[6]与和厚朴酚[7]，二者互为同分异构体，分子式为C18H18O2。厚朴酚为白色至黄褐色粉末，单体为无色针状结晶[8];和厚朴酚为白色粉末，单体为无色鳞片状晶体，二者均易溶于苯、乙醚、氯仿和乙醇等，均难溶于水。《中国药典》2015年版规定，厚朴酚与和厚朴酚二者在厚朴中的含量不得少于2.0%[9]。现代药理研究表明，厚朴酚与和厚朴酚这2种成分在厚朴中的药用作用有很大关系。厚朴酚有导致肌肉松弛、抗菌[10]、抑制血小板凝集和抗肿瘤[11]等作用，临床上主要使用厚朴酚制作抗菌和抗真菌药物。和厚朴酚对肿瘤细胞有很好的疗效，可诱导肿瘤细胞凋亡[12]、抑制肿瘤转移以及促进肿瘤细胞分化[13-16]；和厚朴酚衍生物有抗焦虑活性[17]，在临床上有广阔的应用前景。

目前，中药溶剂提取最常用的方法为煎煮法[18]、超声提取法、索氏提取法[19]、微波提取法[20]和超临界流体萃取等。为适应工业化生产，根据厚朴酚与和厚朴酚易溶于乙醇且具有酚羟基等特点，本实验通过单因素水平实验分析了pH值、乙醇体积分数、液料比和提取次数4个因素对厚朴酚与和厚朴酚提取率的影响，通过设计正交实验进一步优化提取条件。该实验旨在建立和优选厚朴中厚朴酚与和厚朴酚的提取工艺模式，为深入开发和利用厚朴提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 LC-20AT型高效液相系统：(日本岛津公司)；色谱柱为C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；KH-250DE型数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；电子分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；pH精密试纸(上海三爱思试剂有限公司)。

1.2试药 厚朴药材(购于湖北恩施)；无水乙醇，浓硫酸(分析纯，南京化学试剂有限公司)；氢氧化钠(湖南尔康制药有限责任公司)；甲醇(色谱纯，山东禹王实业有限公司化工分公司)。

2 方法与结果

2.1厚朴酚与和厚朴酚含量测定的方法学考察

2.1.1色谱条件 色谱柱：C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水(78∶22)；检测波长：294 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：40 ℃。在上述色谱条件下，和厚朴酚与厚朴酚得以分离，保留时间分别为10.01和14.48 min。

2.1.2线性关系考察 称取厚朴酚与和厚朴酚适量，置于100 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成混合对照品溶液。分别取混合对照品溶液0.5，2，4，6，8和10 mL，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成不同质量浓度梯度的系列对照品溶液，进样20 μL，记录色谱图。以对照品质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线。

得到厚朴酚与和厚朴酚的线性回归方程分别为y1=3×107x1+33 112和y2=3×107x2+ 24 121，r=0.999 9。结果表明，厚朴酚与和厚朴酚在0.004 5～0.09和0.007 2～0.144 mg·mL-1范围内，线性关系良好。

2.1.3精密度实验 取2.1.2项下制备的对照品溶液，按照2.1.1项下色谱条件，注入高效液相色谱仪，分别连续测定6次，记录色谱图，测定峰面积，计算得厚朴酚与和厚朴酚的RSD值分别为1.71%和1.13%，结果表明，含量测定的精密度良好，符合定量测定的要求。

2.1.4稳定性考察 取2.1.2项下制备的对照品溶液，室温避光放置，分别于0，3，6，9，12和24 h进样测定，进样记录峰面积，计算RSD值分别为0.01%和1.13%。结果表明，厚朴酚与和厚朴酚在24 h内稳定性良好。

2.1.5重复性实验 按照2.1.2项下方法平行制备6份对照品溶液，经微孔滤膜过滤后分别注入高效液相色谱仪，记录峰面积，计算厚朴酚与和厚朴酚的RSD值均为0.01 %，结果表明，含量测定的重复性良好。

2.1.6加样回收率实验 在3份对照品溶液中依次加入不同质量浓度的厚朴酚与和厚朴酚对照品，进样20 μL，计算得厚朴酚与和厚朴酚的平均加样回收率分别为101.6%和100.6%，RSD值分别为1.60%和0.90%。

2.2厚朴药材中厚朴酚与和厚朴酚的含量测定 厚朴药材用药材粉碎机打成粉末，过3号筛，精密称取0.2 g，置于25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，浸泡24 h后，精确量取5 mL提取液，置于25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。取20 μL注入高效液相色谱仪进行含量测定。

《中国药典》2015年版规定，厚朴药材中厚朴酚与和厚朴酚的含量应不少于2.0%。含量测定结果表明，每1.0 g厚朴药材中含有厚朴酚与和厚朴酚的总量为2.604×10-2g，含量在2.0%以上。

图1HPLC图

A.对照品；B.阴性对照；C.供试品；1.和厚朴酚；2.厚朴酚。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference substance；B.negative control；C.sample；1.honokiol；2.magnolol.

2.3厚朴酚与和厚朴酚的提取 称取厚朴药材粉末10 g，置于烧杯中，按照相应的液料比加入不同体积分数和pH值的乙醇溶液，将烧杯密封，放入超声清洗仪中，设置超声清洗仪参数为25 ℃，频率为100 Hz，提取2次，每次提取完成后用真空泵减压抽滤，合并提取液。精确量取提取液0.1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。取20 μL注入高效液相色谱仪进行含量测定。

2.4单因素实验

2.4.1不同体积分数乙醇 称取厚朴药材粉末10 g，置于10倍量体积、pH值为7的不同体积分数的乙醇溶液中，超声提取1次，0.5 h。取提取液1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，进样20 μL，计算提取率。选择体积分数为20%，35%，50%，65%，80%和95%的乙醇溶液作为研究水平。实验结果表明，厚朴酚与和厚朴酚的提取率随乙醇体积分数的升高先增加后逐渐趋于平稳，在乙醇体积分数为65%时即达到峰值，故乙醇体积分数的水平选择为50%，65%和80%。

2.4.2不同pH值 称取厚朴药材粉末10 g，置于10倍量体积、不同pH值的体积分数为65%的乙醇溶液中，超声提取1次，0.5 h。pH值选择6，7，8，9和10为研究水平。实验结果表明，厚朴酚与和厚朴酚的提取率随着pH值的增加而增加。因pH值为10时，溶液颜色为深绿色，怀疑在此pH值时，部分厚朴酚与和厚朴酚被氧化，因此不选择pH值为10进行实验，选择pH水平因素为7，8和9。

2.4.3不同提取次数 称取厚朴药材粉末10 g，置于10倍量体积、pH值为7的体积分数为80%的乙醇溶液中，提取数次，每次0.5 h。取提取液1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，进样20 μL，计算提取率。选择提取次数为1，2，3，4和5作为研究水平。实验结果表明，提取率随提取次数的增多而增加，在提取3次时达到平衡，在提取2次时能达到90%以上，但在提取次数为1次时，提取率已经达到80%，可认为提取次数对提取率的影响较小，在设计正交表格时不列入考虑范围，在进行实验时选择提取2次作为实验条件。

2.4.4不同液料比 单因素实验称取厚朴药材粉末10 g，置于不同体积、pH值为7的体积分数为65%的乙醇溶液中，提取1次，0.5 h。液料比选取5∶1，8∶1，10∶1，12∶1和15∶1作为研究水平。实验结果表明，随着液料比的增加对于碱性乙醇超声提取的提取率也随之增加，因此选择5∶1，10∶1和15∶1共3个液料比作为水平因素。

2.5正交实验设计及结果分析 在药材厚朴粉末厚朴酚与和厚朴酚提取的正交实验设计中，依据单因素实验所确定的因素，将乙醇体积分数、pH值和液料比做3因素3水平正交实验。因素水平见表1，正交实验结果见表2，方差分析结果见表3。

表1正交实验因素与水平

Tab.1 Factors and levels of the orthogonal experiment

水平A,乙醇体积分数/%B,pH值C,液料比/mL·g-115075∶1265810∶1380915∶1

表2正交优化实验结果

Tab.2 Results of the orthogonal experiment

实验序号ABC提取率/%18085∶185.59280910∶157.90365710∶154.6746595∶1100.78565815∶183.50650915∶114.7575075∶131.82880715∶142.52950810∶137.42K183.99129.01218.19K2238.95206.51144.39K3186.01173.43140.77R154.9677.5077.42

以《中国药典》2015年版规定的厚朴药材中厚朴酚与和厚朴酚的含量为指标，进行3水平3因素正交实验，见表2。由表2可知，乙醇体积分数对厚朴酚与和厚朴酚的提取率影响最大，其次为pH值，液料比影响最小，见表3。由表3可知，乙醇体积分数对提取率的影响较为显著，差异有统计学意义，pH值和液料比影响不明显。综合分析，优选厚朴酚及和厚朴酚提取的优选条件是：A2B2C1，即：pH值为8、乙醇体积分数为65%、液料比为5∶1、提取次数为2次。

表3正交实验方差分析结果

Tab.3 Results of variance analysis of the orthogonal experiment

因素偏差平方和自由度方差F显著性乙醇体积分数4135.92522067.96335.489<0.05pH值1008.1862504.0938.651>0.05液料比1192.2342596.11710.230>0.05误差 116.5402 58.270

2.6正交实验验证 以厚朴药材中厚朴酚与和厚朴酚的提取率为指标，按照正交优选实验选出的工艺条件：乙醇体积分数为65%，pH值为8，提取次数为2次，每次提取时间为0.5 h，液料比为5∶1，进行3次重复实验，每次实验的提取液平行取3份样品，得到平均提取率为94.08%，104.50%和101.73%。结果表明，所选工艺条件厚朴酚与和厚朴酚的提取效率较高且重复性较好。

3 讨论

近年来，厚朴已成为渐危种，优质的厚朴药材越发珍贵，可见对厚朴中有效成分的提取对于资源保护有重要意义。厚朴酚与和厚朴酚作为厚朴的主要活性成分，在抗癌和抗菌方面效果突出，在临床上有较为广阔的应用前景。实验中用碱性乙醇超声提取法提取厚朴药材中的厚朴酚与和厚朴酚，利用超声的空化效应，使植物细胞壁加速破裂，有利于有效成分的快速溶出。同时结合了厚朴酚与和厚朴酚的结构特点，二者均是酚类物质，呈酸性，在乙醇溶液中加入适量的氢氧化钠溶液进行调节，使有效成分能更好地溶解在溶液中，进一步提高提取效率。经优化后的提取方法操作简单、提取效率高，可为工业提取厚朴酚与和厚朴酚提供参考。

本实验通过单因素水平实验分析了pH值、乙醇体积分数、液料比和提取次数4个因素对厚朴酚与和厚朴酚提取率的影响。依据单因素实验所确定的因素，将乙醇体积分数、pH值和液料比设计3因素3水平正交实验，进一步优化提取条件，为深入开发和利用厚朴提供理论依据。厚朴酚与和厚朴酚为同分异构体，其结构、性质类似，但药理活性不同，因此，将二者从厚朴中提取后，将其进一步分离纯化也是非常重要的步骤，在笔者之后的工作中将对其进行研究。

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