新疆假龙胆不同部位中3种环烯醚萜类成分的含量比较研究

朱丹丹，杨建华,2，居博伟，曹丹丹，许欢欢，吴姗姗，姜湘英，胡君萍*

(1.新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学第一附属医院，乌鲁木齐 830011；3.新疆巴音郭楞蒙古自治州食品药品检验所，库尔勒 841000)

新疆假龙胆Gentianellaturkestanorum(Gand.) Holub为龙胆科假龙胆属1或2年生草本植物，主要分布在新疆。新疆假龙胆是维吾尔医习用药材，具有清热解毒、利湿消肿等功效，维医中常用于治疗关节炎，民间用其全草泡茶治疗感冒、发热等症[1-3]。研究显示，假龙胆属植物主要含有环烯醚萜类、黄酮类和三萜类成分[4-5]。课题组前期对10批不同海拔地区的新疆假龙胆药材进行了活性成分的含量测定[6-7]，发现各批次药材均以环烯醚萜类成分为主，其含量接近或超过2%，其他成分含量较低，提示环烯醚萜类成分可能是新疆假龙胆发挥药效的主要物质。现代药理研究表明，环烯醚萜类成分具有抗菌、抗氧化、神经保护、保肝利胆和增强免疫等生物活性[8-13]。目前关于新疆假龙胆不同极性部位及不同部位中环烯醚萜类成分分布规律的研究尚未见报道，为了进一步研究新疆假龙胆不同极性部位及不同部位与药效之间的联系，本研究采用经典提取分离技术制备了新疆假龙胆不同极性部位，以獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷为考察指标，比较了它们在不同极性部位及不同部位中的含量，为后续新疆假龙胆的药理作用活性部位研究及资源合理开发利用提供依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 Waters Alliance 2695高效液相色谱仪，Waters 2487紫外检测器，Empower色谱工作站(沃特世公司)；Sartorius BP211D电子天平(赛多利斯集团)；KQ-200VDB型双频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；R-3旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司)；FJY1002-UVF基因研究型超纯水机(青岛富勒姆科技有限公司)；1001型冷冻干燥机(美国Edwards Pirani公司)；HHS型电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)。

1.2试药 对照品：獐牙菜苦苷(批号20120129)、龙胆苦苷(批号20120114)和獐牙菜苷(批号PN1125SA13)和均购自上海源叶生物科技有限公司；水为超纯水；甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

新疆假龙胆药材经姜湘英主任药师鉴定为新疆假龙胆Gentianellaturkestanorum(Gand.) Holub的全草。

2 方法与结果

2.1新疆假龙胆不同极性部位的制备 称取新疆假龙胆500 g，剪碎，加入12倍量体积的乙醇，加热回流提取3次，每次2 h，合并提取液，减压浓缩至无醇味，冷冻干燥得到新疆假龙胆醇提物。将上述醇提物加适量水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分别萃取3次，浓缩回收不同极性部位的萃取液，干燥后得到新疆假龙胆石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水部位的浸膏。

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液 取3种对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，得混合对照品储备液。分别精密移取混合对照品储备液8 mL，置于25 mL量瓶中，用甲醇稀释成獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷质量浓度分别为161.9，158.4和37.1 mg·L-1的混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液

2.2.2.1新疆假龙胆不同极性部位供试品溶液 精密称取乙醇部位0.1 g，置于具塞三角瓶中，加入甲醇25 mL，称定质量，超声30 min(功率100 W，频率50 kHz)，放冷，用甲醇补足减失的质量，取上清液过0.22 μm滤膜，作为乙醇部位供试品溶液。石油醚、乙酸乙酯和水部位供试品溶液制备方法同上。正丁醇部位按照上述方法制备经超声后，放冷，用甲醇补足减失的质量，精密吸取溶液1 mL，置于5 mL量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，过0.22 μm滤膜，作为正丁醇部位供试品溶液。

2.2.2.2新疆假龙胆不同部位供试品溶液 将新疆假龙胆不同部位分别粉碎，过8号筛，精密称取各部位粉末0.1 g，置于具塞三角瓶中，按照2.2.2.1项下方法进行制备，即得不同部位供试品溶液。

2.3色谱条件及系统适用性实验 色谱柱：Cosmosil packed column 5 C18-PAQ(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；柱温：25 ℃；流动相：甲醇-4 mL·L-1磷酸水溶液(19∶81)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：242 nm；进样量：10 μL。在选定的色谱条件下，待测成分与相邻色谱峰分离度均大于1.5，理论塔板数均大于15 000，对照品和样品色谱图见图1。

图1HPLC图

A.混合对照品；B.新疆假龙胆醇提物；C.水部位；D.正丁醇部位；E.乙酸乙酯部位；F.石油醚部位；G.根；H.茎；I.花；J.叶；1.獐牙菜苦苷；2.龙胆苦苷；3.獐牙菜苷。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.mixed reference substances；B.alcohol extract ofGentianellaturkestanorum；C.water polarity；D.n-butyl alcohol polarity；E.ethyl acetate polarity；F.petroleum ether polarity；G.root；H.stem；I.flower；J.leaf；1.swertiamarin；2.gentiopicroside；3.sweroside.

2.4线性关系考察 精密吸取2.2.1项下制备的混合对照品储备液0.25，1，2，3，5和8 mL，分别置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为系列质量浓度对照品溶液。分别吸取上述溶液各10 μL，进样测定，记录峰面积。以对照品的质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)进行线性回归，得獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷的回归方程，结果分别为y=17 790x-31 408，y=8 250x-14 668和y=10 222x-4 718.1。结果表明，獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷的质量浓度分别在4.04～129.54(r=0.999 4)，3.96～126.73(r=0.999 3)和0.93～29.70 mg·L-1(r=0.999 5)范围内线性关系良好。

2.5精密度实验 精密吸取同一混合对照品溶液(獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷质量浓度分别为80.96，79.20 和18.56 mg·L-1)10 μL，按照2.3项色谱条件连续进样6 次，测得獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷峰面积的RSD值(n=6)分别为1.37%，1.69%和1.45%。结果表明，精密度良好。

2.6重复性实验 分别称取6份新疆假龙胆乙酸乙酯部位适量，精密称定，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，进样10 μL，测得新疆假龙胆乙酸乙酯部位中獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷峰面积的RSD值(n=6)分别为1.74%，1.63%和1.89%。结果表明，该方法重复性良好。

2.7稳定性实验 精密吸取新疆假龙胆乙酸乙酯部位供试品溶液10L，分别于0，2，4，8，12和24 h进样，测得新疆假龙胆乙酸乙酯部位中獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷峰面积的RSD值分别为1.28%，1.71%和1.61%。结果表明，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8加样回收率实验 精密称取9份新疆假龙胆乙酸乙酯部位0.05 g，分别加入一定量对照品(分别按照相当于乙酸乙酯部位的80%，100%和120%量加入獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷对照品)，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，进样10L测定，计算加样回收率，结果见表1。由表1可知，獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷的平均回收率(n=3)分别为99.3%，98.2%和98.9%；97.4%，98.6%和98.3%；97.1%，98.0%和97.5%。

表1加样回收率实验结果

Tab.1 The results of recovery tests

(n=3)

2.9样品测定 分别精密称取新疆假龙胆醇提物及其各极性部位样品粉末，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.3项下色谱条件进样10 μL，用外标法计算獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷的含量，结果见表2。

表2样品含量测定结果

Tab.2 The results of sample content determination

(±s，n=3)

注：-表示未检出。

3 讨论

3.1流动相的选择 本实验先后考察了甲醇-水、甲醇-磷酸溶液、乙腈-磷酸溶液系统的分离情况和出峰时间，比较各流动相出峰的峰形、分离度、出峰时间以及拖尾情况，最终选择甲醇-4 mL·L-1磷酸水溶液系统等度洗脱程序得到的色谱峰峰形较好，分离效果最佳。

3.2检测波长的选择 用紫外分光光度计分别测定獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷的最大吸收波长分别为238，270和242 nm，其中龙胆苦苷在242 nm处也有较大吸收。为保证被测成分在同一波长下均有较强响应，综合考虑最终设定在242 nm处检测獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷。

3.3含量测定结果分析 新疆假龙胆不同部位中3种化学成分含量存在明显差异，含量顺序为花>叶>根>茎；叶和花中的环烯醚萜苷含量累积达2%以上，其中花中能检出獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐芽菜苷，且獐牙菜苦苷含量为龙胆苦苷含量的2倍，獐芽菜苷含量最低，仅为0.06%，而在其他部位中未检出獐芽菜苷，这可能与植物代谢有关；獐牙菜苦苷为叶中的主要成分，含量达1.90%；根中龙胆苦苷含量较高，是獐牙菜苦苷含量的11倍；茎中獐牙菜苦苷和龙胆苦苷含量均较低。提示新疆假龙胆的叶、花和根具有较高的药用价值，不同部位中3种环烯醚萜苷的含量之间的差异，也为后续分离单体提供理论支撑，或作为研究环烯醚萜苷主要的制备原料，根据含量测定结果可知，维医蒙医民间药用新疆假龙胆全草有一定的科学依据。新疆假龙胆为1或2年生草本植物，在开花时期采收花和叶可有效的保护新疆假龙胆，使其在得到充分利用的同时，防止被大量采挖导致野生资源和生态环境遭到破坏。新疆假龙胆若能合理地开发利用也能够带动农民种植，增加经济和社会效益。

由于正丁醇中环烯醚萜类成分含量过高，为减轻色谱柱载样量，且使各成分均在线性范围内，故将正丁醇部位溶液稀释5倍，以便测定。新疆假龙胆醇提物及其不同极性部位主要含有獐牙菜苦苷和龙胆苦苷，獐牙菜苷含量均较低；3种活性成分含量存在差异，含量高低顺序为正丁醇部位>醇提物>水部位>乙酸乙酯部位，石油醚部位未能检出此3种活性成分；课题组前期已测得新疆假龙胆全草3种成分含量累积为2%，新疆假龙胆醇提物含量累积超过5%，与全草相比有所提高[6]，通过初步的萃取技术，新疆假龙胆正丁醇部位环烯醚萜类成分的含量超过12%，明显高于醇提物，说明对醇提物进一步萃取是很有必要的，此过程对3种活性成分进行了有效富集，也为进一步纯化分离提供了实验依据。本研究为后续筛选新疆假龙胆药理活性部位，明确3种活性成分含量与药理活性相关性提供了参考依据。

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