罗汉松种子挥发油及石油醚提取物GC-MS分析

赵凯丽，黄增琼

(广西医科大学药学院，南宁 530021)

罗汉松Podocarpusmacrophyllus(Thunb.)D.Don又称土杉或短叶土杉，为竹柏科植物，主要分布在我国江苏、浙江、福建、广东和广西等地，在广西北海有较大规模种植。罗汉松果实由种子和花托组成，文献记载其具有补肾、益肺、治疗血虚面色萎黄和心胃痛的功效[1]。目前，国内外对罗汉松叶子的化学成分进行了较为深入的研究[2-8]。Park H S等[3-5]从罗汉松叶中分离得到罗汉松内酯和罗汉松二萜等十几种化学成分。近年研究表明，罗汉松果实醇提物具有降血脂、保肝和抗氧化作用；种子醇提物可抑制胃癌细胞的增殖[9-10]。本课题组也报道了罗汉松种子和花托的氨基酸、矿质元素以及花托多糖的含量[11-12]。此外，国内外鲜有对罗汉松种子化学成分进行研究的报道。本文采用GC-MS法分析罗汉松种子挥发油及石油醚提取物的化学组成，为罗汉松种子的进一步开发利用提供依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 WJX-A500高速多功能粉碎机(上海缘沃工贸有限公司)；EL-204电子天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；Varian 300-MS气相色谱-质谱联用仪(美国瓦里安公司)。

1.2试药 罗汉松种子采自广西北海，经广西医科大学药学院生药学教研室朱丹副教授鉴定为竹柏科植物罗汉松Podocarpusmacrophyllus(Thunb.)D.Don的种子。石油醚(30～60 ℃)和无水硫酸钠均为分析纯。

2 方法

2.1挥发油的提取 将罗汉松种子自然风干，粉碎，过20目筛，称取100 g置于圆底烧瓶中，加入1 000 mL去离子水，浸泡0.5 h，保持微沸蒸馏8 h。馏出液以石油醚萃取3次，合并石油醚层，加入无水硫酸钠脱水，50 ℃减压回收石油醚，得气味芳香的无色液体，伴有大量无色针状结晶，置于4 ℃冰箱中备用[13]。

2.2石油醚提取物的提取 称取罗汉松种子粉末40 g，置于索氏提取器中，加入360 mL石油醚提取5 h，减压回收溶剂，得墨绿色石油醚提取物，置于4 ℃冰箱中备用。

2.3GC-MS分析 色谱条件：VF-5 ms石英毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；载气：高纯氦气；流速为1.0 mL·min-1；进样量：1 μL；分流比为10∶1；进样温度：250 ℃；升温程序：50 ℃，保持4 min，以5 ℃·min-1的速率升温至250 ℃，再以10 ℃·min-1的速率升温至280 ℃，保持5 min。质谱条件：EI离子源；电离能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；倍增器电压1 250 V；扫描质量范围m/z45～500;图谱检索：NIST05质谱库。

3 结果

3.1挥发油的化学组成 罗汉松种子挥发油提取率为0.16%。GC-MS分析总离子流图见图1，经质谱库检索，鉴定出2个化合物：川芎嗪(四甲基吡嗪)和马鞭草烯酮，相对百分含量分别为97.27%和2.73%。由于川芎嗪含量过高，掩盖了其他低含量成分的信号峰，导致其他成分无法被鉴定。因此，将该峰屏蔽后进行第2次测定，见图2。结果鉴定出43种化合物，见表1，以萜类和芳香族类化合物为主，主要成分分别为(-)-匙叶桉油烯醇(16.89%)、石竹烯氧化物(8.49%)、石竹烯(6.63%)、古巴烯(5.49%)和(S)-马鞭草烯酮(5.20%)。三甲基吡嗪(0.35%)和高级脂肪酸n-棕榈酸(0.31%)也被检测到。

3.2石油醚提取物的化学组成 罗汉松种子石油醚提取物的提取率为0.93%。经GC-MS法分析，共鉴定出53个化合物，见表2，其中萜类36个，酯7个，脂肪酸2个，甾体化合物2个，其他类化合物6个。含量最高的4种成分分别为：海松酸(15.54%)、璎柏酸甲酯(15.21%)、石竹烯氧化物(10.08%)和古巴烯(9.62%)。此外，挥发油中的主要成分川芎嗪和(S)-马鞭草烯酮也被检测到，相对百分含量分别为1.28%和0.57%。

图1罗汉松种子挥发油第1次测定总离子流图

Fig.1 Ion chromatogram of the first determination of essential oil ofPodocarpusmacrophyllusseeds

图2罗汉松种子挥发油第2次测定总离子流图

Fig.2 Ion chromatogram of the second determination of essential oil ofPodocarpusmacrophyllusseeds

表1罗汉松种子挥发油GC-MS分析结果

Tab.1 Analysis results of essential oil ofPodocarpusmacrophyllusseeds by GC-MS

序号保留时间/min英文名称中文名称相对含量/%匹配度/%15.74ethylbenzene乙苯0.5179.6210.29trimethylpyrazine三甲基吡嗪0.3593.5311.73benzeneacetaldehyde苯乙醛0.6383.5414.20trans-mentha-2,8-dienol反-薄荷-2,8-二烯醇0.8382.7514.65cis-menth-2,8-diene-1-ol顺-薄荷-2,8-二烯-1-醇0.6584.4614.79trans-(-)-pinocarveol反-(-)-松香芹醇3.2089.3714.94cis-verbenol顺-马鞭草烯醇4.0193.0815.084-ethyl-1,3-benzenediol4-乙基-1,3-苯二酚1.0480.1915.223,5-diethyl-2-methylpyrazine3,5-二乙基-2-甲基吡嗪0.4670.61016.00terpinen-4-ol松油烯-4-醇0.8183.61116.21isocarveol异香芹醇1.6074.51216.48myrtenol桃金娘烯醇1.6387.11316.82(S)-verbenone(S)-马鞭草烯酮5.2093.41417.14cis-carveol顺-香芹醇2.8791.81517.53trans-carveol反-香芹醇0.6282.21617.87(S)-carvone(S)-香芹酮0.8189.41719.213-ethyl-4-hydroxy-benzeneamine3-乙基-4-羟基-苯胺0.6275.51820.69α-cubebeneα-荜澄茄油烯3.5992.31921.47copaene古巴烯5.4994.0

表1(续)罗汉松种子挥发油GC-MS分析结果

Tab.1(Continued) Analysis results of essential oil ofPodocarpusmacrophyllusseeds by GC-MS

序号保留时间/min英文名称中文名称相对含量/%匹配度/%2021.82β-elemeneβ-榄香烯1.9891.92122.63caryophyllene石竹烯6.6394.62223.55α-caryophylleneα-石竹烯1.6590.32324.011-isopropyl-7-methyl-4-methylene-1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahydronaphthalene1-异丙基-7-甲基-4-亚甲基-1,2,3,4,4a,5,6,8a-八氢萘0.2881.12424.19β-cubebeneβ-荜澄茄油烯0.9080.22524.39α-selineneα-蛇床烯0.9985.82624.55γ-elemeneγ-榄香烯2.9785.22725.08D-cadineneD-荜澄茄烯1.9392.62826.52(-)-spathulenol(-)-匙叶桉油烯醇16.8994.22926.65caryophylleneoxide石竹烯氧化物8.4993.23027.30humuleneepoxideⅡ蛇麻烯环氧化物Ⅱ0.7580.53127.69cubenol荜澄茄油醇0.9276.73227.81alloaromadendreneoxide-(2)别香橙烯氧化物-(2)0.5072.23328.05τ-muurololτ-依兰油醇3.2584.53428.31α-cadinolα-荜澄茄醇2.5791.23528.754,4a,5,6,7,8-hexahydro-4,4a-dimethyl-6-(1-methylethenyl)-2(3H)-naphthalenone4,4a,5,6,7,8-六氢-4,4a-二甲基-6-(1-异丙烯基)-2(3H)-萘酮1.3272.43628.905,6,6-trimethyl-5-(3-oxobut-1-enyl)-1-oxaspiro[2.5]octan-4-one5,6,6-三甲基-5-(3-氧代-1-烯基)-1-氧杂螺[2.5]辛烷-4-酮0.6367.73729.50ledenealcohol喇叭烯醇0.7673.43829.83isoaromadendreneepoxide异香橙烯环氧化物1.0674.83930.05(-)-oplopanone(-)-日本刺参萜酮1.8775.54032.041,3-diphenyl-2-propen-1-one1,3-二苯基-2-丙烯-1-酮0.3479.24133.77sclarene香紫苏烯0.3474.04234.53n-hexadecanoicacidn-棕榈酸0.3174.04337.96(1R)-pimaral(1R)-海松醛0.5975.5

表2罗汉松种子石油醚提取物GC-MS分析结果

Tab.2 Analysis results of petroleum ether extract ofPodocarpusmacrophyllusseeds by GC-MS

序号保留时间/min英文名称中文名称相对含量/%匹配度/%14.612,3-butanediol2,3-丁二醇0.2491.129.70(2-methylpropyl)hydrazine2-甲基丙基肼0.3071.039.86α-pineneα-蒎烯1.1692.5410.01methoxyaceticacidethylester甲氧基乙酸乙酯0.4975.6510.97oxirane-2-carboxylicacid,ethylester2,3-环氧丙酸乙酯0.2971.9614.31D-limoneneD-柠檬烯1.1793.0716.99pyrazine,tetramethyl四甲基吡嗪1.2894.2818.18cis-verbenol 顺-马鞭草烯醇0.8080.9918.82trans-p-mentha-2,8-dienol反-对-薄荷-2,8-二烯醇0.2579.51019.53cis-p-menth-2,8-diene-1-ol顺-对-薄荷-2,8-二烯-1-醇0.1878.01119.68trans-pinocarveol反-松香芹醇0.5888.41221.98(E)-3(10)-caren-4-ol(E)-3(10)-蒈烯-4-醇0.3071.51322.35myrtenol桃金娘烯醇0.3382.81422.89(S)-verbenone(S)-马鞭草烯酮0.5788.41523.47cis-carveol顺-香芹醇0.4683.7

表2(续)罗汉松种子石油醚提取物GC-MS分析结果

Tab.2(Continued) Analysis results of petroleum ether extract ofPodocarpusmacrophyllusseeds by GC-MS

序号保留时间/min英文名称中文名称相对含量/%匹配度/%1623.94isopinocarveol异松香芹醇0.1474.31724.61(S)-carvone(S)-香芹酮0.1886.81829.13α-cubebeneα-荜澄茄油烯3.4595.11930.36copaene古巴烯9.6294.52030.98β-elemeneβ-榄香烯1.9294.12132.20β-caryophylleneβ-石竹烯0.6090.32232.98aromadendren香树烯0.2983.12334.531,2,4a,5,6,8a-hexahydro-1-isopropyl-4,7-dime-thylnaphthalene1,2,4a,5,6,8a-六氢-1-异丙基-4,7-二甲基萘0.5289.82435.07eudesma-4(14),11-diene4(14),11-桉叶二烯1.6988.82535.37α-selineneα-蛇床烯1.2683.82635.52α-muuroleneα-依兰油烯0.9992.22736.171-hydroxy-1,7-dimethyl-4-isopropyl-2,7-cyclode-cadiene1-羟基-1,7-二甲基-4-异丙基-2,7-环癸二烯2.1380.92838.58(-)-spathulenol(-)-匙叶桉油烯醇7.3995.42938.76caryophylleneoxide石竹烯氧化物10.0894.13039.21ledeneoxideⅡ喇叭烯氧化物Ⅱ0.4075.73139.83humuleneepoxideⅡ蛇麻烯环氧化物Ⅱ1.4188.03240.874,4-dimethyl-tetracyclo[6.3.2.0(2,5).0(1,8)]tridecan-9-ol4,4-二甲基-四环[6.3.2.0(2,5).0(1,8)]十三烷-9-醇0.4483.03341.57α-cadinolα-荜澄茄醇1.2485.83442.25isoaromadendreneepoxide异香橙烯环氧化物0.2973.23544.088,14-cedranoxide8,14-环氧柏木烷0.3474.73644.40oplopanone日本刺参萜酮0.3084.93748.18tetrahydro-actinidiolide四氢猕猴桃内酯0.2765.53848.75phthalicacid,butyloctylester邻苯二甲酸丁辛酯0.2588.83951.87dibutylphthalate邻苯二甲酸二丁酯1.2797.34052.18n-hexadecanoicacidn-棕榈酸2.2789.94154.87(-)-sclareol(-)-香紫苏醇0.3476.04257.28isopimara-7,15-dien-3-one7,15-异海松二烯-3-酮0.5472.34357.52oleicacid油酸0.5379.84459.64decahydro-5-(hydroxymethyl)-5,8a-dimethyl-γ,2-bis(methylene)-,(1-α,4a-β,5-α,8a-α)-1-naph-thalenepentanol十氢-5-羟甲基-5,8a-二甲基-γ,2-二亚甲基-,(1-α,4a-β,5-α,8a-α)-1-萘戊醇1.7574.94561.47ethylpimarate海松酸乙酯0.3166.94662.10pimaricacid海松酸15.5479.04763.4116-hydroxy-(-)-kauranoicacid16-羟基-(-)-贝壳杉酸2.0663.04863.78methylcommunate璎柏酸甲酯15.2181.24966.55stevioside甜叶菊苷元0.5069.55066.80abieticacid松香酸0.4876.75168.06estra-5(10)-en-3-one-17-ol,acetate雌二-5(10)-烯-3-酮-17-醇乙酸酯0.3769.05281.4410-nonadecanol10-十九烷醇1.1879.75385.82β-sitosterolβ-谷甾醇1.5782.9

4 讨论

本研究采用水蒸气蒸馏法对罗汉松种子挥发油进行提取，获得含大量无色针状结晶的挥发油。结果表明，该挥发油中某个成分含量极高，经石油醚萃取并回收溶剂即可获得结晶。GC-MS鉴定结果发现，挥发油中川芎嗪的相对百分含量高达97.27%，匹配度94.7%，提示该无色针状结晶为川芎嗪。川芎嗪是一种生物碱类化合物，其在川芎药材中的含量仅为0.005%[14]。含有川芎嗪的单方或复方制剂已广泛用于冠心病和脑缺血等心脑血管疾病的治疗[15-17]。因此，我们认为罗汉松种子中的川芎嗪是罗汉松果实可用于治疗心胃痛的主要物质基础。罗汉松果实中较高的钙(0.09%)、镁(0.07%)和天冬氨酸(0.40%)含量可能对其治疗心胃痛具有辅助作用[11]。

由于川芎嗪在挥发油中的含量极高，其他含量相对较低的化学成分难以被鉴定，因此，实验排除川芎嗪峰后再次进行GC-MS分析，最终鉴定出43种化合物。其中萜类占70%以上，相对百分含量较高的几种萜类化合物，如(—)-匙叶桉油烯醇(16.89%)、石竹烯氧化物(8.49%)和古巴烯(5.49%)等均为植物挥发油中常见的化学成分。研究发现[2]，在罗汉松叶精油所鉴定的30种化合物中，仅含贝壳杉烯(23.62%)1种萜类成分，说明罗汉松种子与叶子的挥发油化学组成有显著区别。值得注意的是，在罗汉松种子石油醚提取物中，我们发现了16-羟基-(-)-贝壳杉酸(2.06%)，可能是由植物中的贝壳杉烯转化形成的。

在石油醚提取物所鉴定的53个化合物中，有19个化合物与挥发油中鉴定的成分相同，相同成分主要为萜类化合物。在这53个化合物中，海松酸(15.54%)含量最高。海松酸是松香的化学成分之一，因其可调控K+通道并抑制睾酮5α-还原酶而具有潜在治疗雄激素依赖性疾病的作用[18-20]。含量较高的石竹烯氧化物(10.08%)和β-石竹烯(0.6%)也是马缨丹叶子挥发油的主要成分，两者具有较好的杀虫活性[21]。实验结果推测，罗汉松种子石油醚提取物可能也具有类似的生物活性。

本研究不仅为提取分离川芎嗪提供了新的药材来源和方法，还将拓宽罗汉松种子在医药上的用途。下一步，我们将对罗汉松种子的化学成分及药理活性进行更深入的研究，为其开发利用提供科学依据。

[1] 江苏新医学院.中药大辞典[M].上海:上海科学技术出版社，1977:1360-1361.

[2] 苏应娟，王艇，张宏达.罗汉松叶精油化学成分的研究[J].武汉植物学研究，1995，13(4):380-382.

[3] Park H S，Takahashi Y，Fukaya H，et al.S(R)-Podolactone D，a new sulfoxide-containing norditerpene dilactone fromPodocarpusmacrophyllusvar.Maki[J].J Nat Prod，2003，66(2):282-284.

[4] Park H S，Kai N，Fukaya H，et al.New cytotoxic norditerpene dilactones from leaves ofPodocarpusmacrophyllusvar.Maki[J].Regular issue，2004，63(2):347-357.

[5] Park H S，Yoda N，Fukaya H，et al.Rakanmakilactones A-F，new cytotoxic sulfur-containing norditerpene dilactones from leaves ofPodocarpusmacrophyllusvar.Maki[J].Tetrahedron，2004，(60):171-177.

[6] Sato K，Sugawara K，Takeuchi H，et al.New cytotoxic nor-and bisnorditerpene dilactones makilactones A-D，fromPodocarpusmacrophyllusD.Don[J].Regular issue，2009，78(6):1453-1462.

[7] Sato K，Sugawara K，Takeuchi H，et al.Antibacterial novel phenolic diterpenes fromPodocarpusmacrophyllusD.Don[J].Chem Pharm Bull(Tokyo)，2008，56(12):1691-1697.

[8] Sato K，Inaba Y，Park H S，et al.Cytotoxic bisnor-and norditerpene dilactones having 7alpha，8alpha-epoxy-9，11-enolide substructure fromPodocarpusmacrophyllusD.Don.[J].Chem Pharm Bull(Tokyo)，2009，57(7):668-679.

[9] 隗磊，周艳，谢云.不同浓度罗汉松实醇提物调血脂及抗氧化的作用研究[J].湖北中医药大学学报，2015，17(1):57-59.

[10]周燕，隗磊，谭志明，等.罗汉松种子提取物对人胃癌细胞的体外抑制作用[J].中国药业，2014，23(13):13-15.

[11]孟军，纪柳梅，刘洋，等.罗汉松实氨基酸和矿质元素含量测定[J].安徽农业科学，2014，42(17):5518-5519，5662.

[12]庞逸敏，林彩琴，潘红娇，等.罗汉松实多糖含量测定方法研究[J].中国药业，2016，25(13):22-24.

[13]哈及尼沙，古丽巴哈尔·卡吾力，阿米乃木·买买提，等.HS-SPME/GC-MS法分析榅桲果实中的挥发性成分[J].西北药学杂志，2017，32(3):263-266.

[14]曹阳，王铁杰，王玉，等.HPLC法测定不同产地川芎中川芎嗪的含量[J].药物分析杂志，2005，25(3):278-280.

[15]朱美晓，黄志芳，肖红斌，等.HPLC法测定川产道地药材川芎中川芎嗪的含量[J].药物分析杂志，2011，31(1):103-106.

[16]蒋春彦，付茜.盐酸川芎嗪注射液治疗冠心病心绞痛31例[J].河南中医，2016，36(12):2099-2101.

[17]陈秋芳，朱晓峰，韩莉，等.丹参川芎嗪注射液治疗不稳定型心绞痛的Meta分析[J].中成药，2016，38(2):272-277.

[18]Mckeon L，Regan F，Burns B，et al.Determination of resin acid composition in rosin samples using cyclodextrin-modified capillary electrophoresis[J].J Sep Sci，2014，37(19):2791-2796.

[19]Sakamoto K，Ohya S，Muraki K，et al.Pimaric acid modulate voltage-gated K+channels by binding its activation gate[J].J Pharmacol Sci，2006，100(Suppl 1):127.

[20]Roh S S，Park M K，Kim Y.Abietic acid from resina pini ofPinusspecies as a testosterone 5α-reductase inhibitor[J].J Health Sci，2010，56(4):451-455.

[21]Safia Z，Aoumeur B.GC and GC/MS analyses of the AlgerianLantanacamaraleaf essential oil:effect againstSitophilusgranariusadults[J].J Saudi Chem Soc，2012，(16):291-297.