芪黄煎剂对胃切除大鼠肠淋巴细胞MAdCAM-1、ICAM-1及其mRNA表达的影响

张 琦，于庆生，周富海，沈 毅，刘举达，王 振，黄 龙

(1.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031；2.安徽省中医药科学院外科研究所，安徽 合肥 230031)

当机体受到外源性损伤、手术或感染毒性物质等打击时，机体应激后可以导致肠黏膜屏障功能受损，从而导致细菌移位，引发肠源性全身感染和脓毒血症，内源性免疫炎性因子可形成“瀑布效应”，导致全身炎性反应综合征和多器官功能障碍综合征。因此，临床上开展了大量以药物干预保护肠黏膜屏障的相关研究，中医药在保护肠黏膜屏障中起到重要的作用。以往研究表明，芪黄煎剂对大鼠胃切除后肠黏膜淋巴细胞免疫功能具有调节作用，对肠黏膜屏障具有保护作用[1-2]。肠淋巴细胞归巢在肠黏膜的保护作用中是决定性的环节[3-4]。笔者通过动物实验观察芪黄煎剂对肠黏膜地址素细胞黏附分子-1(mucosal addressin cell adhension molecule-1，MAdCAM-1)和细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)及其mRNA表达的影响，探讨其保护肠黏膜屏障的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物 清洁级SD大鼠，雄性，60只，7周龄，体质量290～310 g。由安徽省动物实验中心提供，生产许可证号为SCXK(皖)2015-002。

1.2 药品 芪黄煎剂(由黄芪、党参、白术、大黄、厚朴、枳实、黄芩、丹参组成，质量比为20∶20∶20∶10∶10∶10∶12∶15，总质量为234 g)：饮片均由安徽中医药大学第一附属医院中药制剂中心提供，经过煎煮、过滤、浓缩，制成1.0 g/mL的生药煎剂，放入4 ℃冰箱内保存，给药前复温至30 ℃。肠内营养制剂能全素(整蛋白型粉剂)：荷兰纽迪希亚出口有限公司，生产批号为H20140007。

1.3 试剂 ICAM-1(bs-0608R)兔抗大鼠单克隆抗体(批号9988520W)、MAdCAM-1(bs-11179R)兔抗大鼠单克隆抗体(批号9957416W)：北京博奥森生物工程有限公司；D-Hank液(批号20100927)：Solarbio公司；胎牛血清(批号090506)：杭州四季青生物工程材料有限公司；逆转录试剂盒(RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit，批号00145205)：杭州主诺生物技术有限公司；GoldView核酸染料(批号130618)：赛百盛基因技术有限公司。

1.4 仪器 电子天平(岛津AUY120)：日本；高速冷冻离心机(德国2-16KL)：广州市百菱生物科技有限公司；流式细胞仪(EPICS XL-MCL 4C)：美国COULTER公司；荧光定量PCR仪(PIKOREAL 96)：美国Thermo；医用Olympus显微照相设备(PM-20型)：Olympus光学工业株式会社。

2 方法

2.1 动物模型复制、分组及给药 将大鼠适用性饲养7 d后随机分为3组，分别是假手术组、模型组、芪黄煎剂组，每组20只。参照课题组既往研究方法[1-2,5]，模型组、芪黄煎剂组均行胃切除术。用10%无菌水合氯醛腹腔注射麻醉。麻醉后将大鼠仰卧位固定，剪除腹毛，75%乙醇无菌操作，术者戴无菌手套，铺无菌洞巾，沿腹部正中切口剪开皮肤、肌肉，暴露腹腔胃体部，切除部分胃体前壁后，用丝线全层缝合。将距离屈氏韧带10 cm处的空肠前壁用12号注射器针头戳孔，行小肠造瘘，将直径1.0 mm硅胶导管自戳孔处置入空肠并固定，腹壁戳口经皮下隧道后引出于后背部，作为给药途径，放置弹簧保护装置缝合固定于皮肤。假手术组大鼠不予以胃切除，仅行腹部正中切开后随即缝合。手术清醒后置笼内自由活动，仔细观察大鼠一般情况。其中模型组仅给予能全素肠内营养，即手术当天禁食、禁水，术后第1天开始给药，通过硅胶管用10 mL注射器通过微量注射泵缓慢、匀速、持续注入小肠内。每日能全素肠内营养量=[(120 kJ/(kg·d)×0.3 kg)]/(8.3 kJ/mL)=4.3 mL/d。计算依据：按120 kJ/(kg·d)提供热量，160 g能全素用温开水溶解成500 mL溶液，每100 mL含830 kJ热量，每只大鼠按300 g计算。每日2次滴注，速度控制为2 mL/h，连续应用1周。滴注完成后以2 mL生理盐水封管，防止硅胶管堵塞。芪黄煎剂组大鼠胃切除后在滴注营养液能全素前给予约6 mL中药芪黄煎剂，按20 g/kg换算，给药方法完全同模型组。假手术组大鼠不给予能全素和芪黄煎剂滴注。

2.2 标本制作与指标检测

2.2.1 标本采集 干预1周后，开腹前操作步骤与复制大鼠手术创伤模型的方法相同,进入腹腔后，借助放大镜寻找肠淋巴干，针头刺入后引流淋巴液以备用。然后分离PP结，即将淋巴液引流完成后，腹腔内分离取出整个小肠放置于培养皿中，生理盐水冲洗直至干净，再用含5%胎牛血清的D-Hank液冲洗肠道2遍，再次放置培养皿中。经肉眼辨认后，用剪刀剪下PP结，将一半PP结用10%甲醛固定，用作MAdCAM-1、ICAM-1蛋白含量检测。将另一半PP结置于冻存管中，放入-80 ℃冰箱冻存，用于检测MAdCAM-1、ICAM-1 mRNA转录水平。

2.2.2 指标检测 采用荧光定量PCR仪检测PP结中MAdCAM-1、ICAM-1 mRNA。将温度与荧光强度变化求导(单峰熔解曲线)。在整个PCR完成后进行熔解曲线的设置，温度从60 ℃升至95 ℃，每升高1 ℃仪器会自动收集荧光信号，得到的熔解曲线是逐渐下降的过程，在Tm值下降最快。首先求出样品目的基因的Ct值，再求出内参照β-actin基因的平均Ct值，应用参照基因β-actin对未处理样品和药物处理样品进行校正，然后对未处理样品和药物处理样品的ΔCt进行归一化：ΔΔCt=ΔCt(药物处理样品)-ΔCt(未处理样品)。最后，根据ΔΔCt算出药物处理样品与未处理样品间基因的表达差异，并表示为2-ΔΔCt值。

注：RT-PCR引物合成序列进行40个循环。

MAdCAM-1：扩增长度为118 bp，退火温度为58 ℃。

正链：5′-GGCAGGTGACCAGTCTGTATGTT-3′；

反链：5′-CAGTAGGCAAGGAAGGCGAGT-3′。

ICAM-1：扩增长度为161 bp，退火温度为58 ℃。

正链：5′-CTGGAGAGCACAAACAGCAGAGAT-3′；

反链：5′-ATGGGAGCTGAAAAGTTGTAGATTC-3′。

采用常规免疫组织化学法检测PP结中MAdCAM-1、ICAM-1的表达水平，PP结中MAdCAM-1、ICAM-1表达阳性的细胞胞膜呈现棕黄色。采用通用医学图像分析软件2.0(北京中科恒业科技有限公司)，参照使用说明，采用双盲方式于显微镜下计数切片中各视野内棕黄色阳性细胞数量，每只大鼠选取1张切片，每张切片随机选取5个高倍视野(10×40倍)，取5个视野的平均值，以平均值作为单个大鼠的表达水平，以某组所有大鼠表达水平的均数作为该组大鼠的表达水平。计算出每只大鼠平均每个视野MAdCAM-1、ICAM-1阳性表达的光密度值。

3 结果

3.1 3组大鼠PP结中MAdCAM-1、ICAM-1表达水平比较 与假手术组比较，模型组MAdCAM-1、ICAM-1表达水平显著降低(P<0.05)；与模型组比较，芪黄煎剂组MAdCAM-1、ICAM-1表达水平显著升高(P<0.05)。见表1和图1、图2。

3.2 3组大鼠PP结中MAdCAM-1、ICAM-1 mRNA相对表达水平比较 与假手术组比较，模型组MAdCAM-1、ICAM-1 mRNA相对表达水平显著降低(P<0.05)；与模型组比较，芪黄煎剂组MAdCAM-1、ICAM-1 mRNA相对表达水平显著升高(P<0.05)。见表2。

表1 3组大鼠PP结中MAdCAM-1、ICAM-1 表达水平比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；OD(optical density)：光密度

注：A．假手术组；B．模型组；C．芪黄煎剂组图1 3组大鼠PP结中MAdCAM⁃1表达水平(免疫组织化学染色，10×40倍)

注：A．假手术组；B．模型组；C．芪黄煎剂组图2 3组大鼠PP结中ICAM⁃1表达水平(免疫组织化学染色，10×40倍)

表2 3组大鼠PP结中MAdCAM-1、ICAM-1 mRNA 相对表达水平比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

4 讨论

肠黏膜发挥免疫效应是通过肠淋巴细胞归巢实现的[3,6]。其分子基础是淋巴细胞归巢受体与配体的相互辨认与结合。此过程中配体作为血管内皮细胞地址素，在介导淋巴细胞向黏膜部位的定向归巢中发挥重要作用。淋巴细胞归巢中最具有代表性的两种配体为MAdCAM-1与ICAM-1。MAdCAM-1是一种分子量为60 kD的糖蛋白，是黏附分子免疫球蛋白超家族中的一员，主要表达于肠道黏膜相关淋巴组织[7]，识别和介导归巢受体α4β7和L-选择素。MAdCAM-1选择性表达于PP结及肠黏膜固有层的高内皮静脉(high endothelial venules，HEV)，其分子基础是同淋巴细胞上的归巢受体分子整合素α4β7结合后向黏膜部位定向归巢。ICAM-1属于黏附分子中免疫球蛋白超家族，分子量70～110 kD的跨膜糖蛋白，细胞分化群是CD54，它通过与其受体的特异性结合，使白细胞、炎性细胞和肿瘤细胞等与内皮细胞间的黏附作用增强，促进内皮细胞活化。ICAM-1识别和介导归巢受体淋巴细胞功能相关抗原-1(lymphocyte function-associated antigen-1, LFA-1)，二者结合后介导淋巴细胞强烈黏附于内皮细胞上[8-9]。

淋巴细胞归巢配体MAdCAM-1与ICAM-1作为一种重要的细胞间黏附分子，对其分子数量与基因表达的干预决定了其归巢的过程。通常干预的过程可以受到单克隆抗体、细胞因子、药物及肠内营养等的影响[10-11]。李凯等[12]应用参青方治疗溃疡性结肠炎，通过药物干预，发现模型组MAdCAM-1蛋白表达与基因转录水平均高于正常组，经用中药干预治疗后，MAdCAM-1的表达水平呈现明显下降趋势。参青方能够阻断MAdCAM-1与其受体结合，即阻断淋巴细胞定向归巢过程，使本病的炎症-免疫反应显著下调，因此认为其治疗作用机制与降低MAdCAM-1在结肠黏膜的表达有关。翟金海等[13]观察发现，清肠化湿方可以显著减少大鼠结肠炎模型结肠黏膜ICAM-1的表达，从而减少炎性细胞表面高表达的ICAM-1与受体LFA-1相互接触、相互作用，减少T淋巴细胞的活化、靶细胞的杀伤引起的炎性反应。彭兰等[7]研究表明，早期肠内营养可以明显增加SD大鼠肠道MAdCAM-1表达，可使淋巴细胞上的配体分子整合素与之结合所形成的复合物在向黏膜部位的定向归巢中发挥重要作用，从而显著保护大鼠重症急性胰腺炎肠道屏障。本实验结果显示，芪黄煎剂组归巢分子配体MAdCAM-1、ICAM-1 mRNA相对表达水平明显高于模型组(P<0.05)。这说明经中药干预后，可促使黏附分子的游出，从而增加黏附分子相对表达水平。由此可见，芪黄煎剂能增加肠黏膜效应部位MAdCAM-1、ICAM-1及其mRNA表达水平。

脾主运化，为“气血生化之源”，胃为“水谷之海”，脾、胃同居中焦。胃肠术后，脾胃受损可出现纳差、便溏、面色苍白、舌淡苔白、脉细弱等脾虚证候，同时胃的受纳水谷功能尚未恢复，又有腑实气滞表现，如进食后腹部胀痛、肛门停止排气排便。因此，胃肠术后脾虚与腑实并存，辨证为虚实夹杂证[14]。本课题组前期也对胃肠术后患者进行了观察研究[5,15]，辨证立法为攻补兼施，补则基于李东垣《脾胃论》补中益气汤思想，攻则基于张仲景《伤寒杂病论》大承气汤思想，二者结合构建了健脾通里方——芪黄煎剂。该方由健脾药物黄芪、白术、党参与通里攻下药物大黄、枳实、厚朴等组成。现代药理研究发现，黄芪具有增强机体非特异性与特异性免疫功能、增强机体耐低氧及应激能力等多种药理功效，可促进胃肠道黏膜淋巴细胞的归巢表达，从而修复胃肠黏膜免疫细胞增殖、分化，起到免疫黏膜屏障修复作用。盛恒炜等[16]研究发现，黄芪预处理能够明显减轻因小肠缺血再灌注损伤所引起的ICAM-1蛋白高表达。张鑫雨等[17]研究发现，黄芪能减轻梗阻性黄疸所致的肝功能损害，对肝细胞有保护作用，其机制可能与降低肝细胞内TNF-α、ICAM-1表达有关。大黄具有泻热通肠、凉血解毒、逐瘀通经的功效，大黄与乌司他丁联合应用能明显降低急性呼吸窘迫综合征患者ICAM-1水平，从而起到对急性呼吸窘迫综合征的保护作用[18]。

通过本实验可推断归巢受体与配体的辨认与结合，是肠淋巴细胞得以归巢的分子基础。而肠固有层或上皮内归巢配体MAdCAM-1、ICAM-1在此过程起到重要作用，使肠黏膜地址素更能捕获归巢受体。本实验表明，芪黄煎剂能增加肠黏膜效应部位MAdCAM-1、ICAM-1及其mRNA表达水平，从而促进肠淋巴细胞归巢过程。该过程顺利实现促进T淋巴细胞和B细胞的分化、成熟和增殖、活化，从而保护胃切除术后肠黏膜免疫屏障，以发挥对肠黏膜的防御和维持其内环境稳定的疗效。

[1] 于庆生,张琦,潘晋方,等.中药芪黄煎剂对大鼠胃癌术后早期免疫功能和肠黏膜屏障的影响[J].中国中西医结合外科杂志,2009,15(2):135-138.

[2] 刘举达,于庆生,王东明,等.芪黄煎剂大鼠胃切除后Peyer结淋巴细胞的影响[J].安徽中医学院学报,2011,30(3)：44-47.

[3] ANNACARIN L,HARDIS R,MARIANNE Q J,et al.Development of gut-homing receptors on circulating B cells during infancy[J]. Clinical Immunology,2011,138:97-106.

[4] WANG H Y,DAINA L,CHRISTOPHER E, et al. Immunopathologies linked to integrin signaling[J]. Semin Immunopathol,2010,32:173-182.

[5] 袁以洋,于庆生,潘晋方,等.芪黄煎剂对胃切除大鼠小肠黏膜上皮内和固有层T淋巴细胞亚群的影响[J].安徽中医学院学报,2012,31(1):42-46.

[6] DE CALISTO J,VILLABLANCA E J,WANG S,et al. T-cell homing to the gut mucosa: general concepts and methodological considerations[J]. Methods Mol Biol,2012,757: 411-434.

[7] 彭兰,赵军,赵平武,等.早期肠内营养在大鼠重症急性胰腺炎肠道免疫屏障中的作用[J].临床消化病杂志,2015,27(1):31-35.

[8] JUNGHEIM K, CASPAR G, USADEL KH, et al. Lymphocyte homing in xenotransplanted human thyroid tissue can be inhibited by LFA-1 and ICAM-1 antibodies[J].Thyroid,2004,14(1):3-11.

[9] VERMA N K, FAZIL M H, ONG S T,et al. Correction: LFA-1/ICAM-1 ligation in human T cells promotes Th1 polarization through a GSK3β signaling-dependent Notch pathway[J]. Immunol,2016,197(5):2039-2040.

[10] 张琦,于庆生,周富海,等.肠淋巴细胞归巢及中医药干预相关性研究[J].中医药临床杂志,2015,27(3):301-303.

[11] 周富海,于庆生,张琦,等.芪黄煎剂对大鼠胃切除后肠淋巴细胞归巢受体α4β7、L-selectin及LFA-1的影响[J].中医药导报,2016,22(2):12-15.

[12] 李凯,张亚利,袁坤,等.参青方对溃疡性结肠炎大鼠黏膜地址素细胞黏附分子表达的影响[J].北京中医药大学学报,2013,36(6):393-397.

[13] 翟金海,沈洪,陈兰,等.清肠化湿方对UC模型大鼠结肠黏膜ICAM-1表达的影响[J].时珍国医国药,2014,25(4):799-80.

[14] 张琦,于庆生,张作军,等.芪黄煎剂对大鼠胃切除术后免疫相关性肠淋巴细胞归巢数量的影响[J].中医药临床杂志,2016,28(3):415-419.

[15] 于庆生,张琦,潘晋方,等.中药芪黄煎剂对大鼠胃癌术后早期免疫功能和肠黏膜屏障的影响[J].中国中西医结合外科杂志,2009,15(2):135-138.

[16] 盛恒炜,沈晶晶,屠伟峰,等.黄芪预处理对大鼠小肠缺血再灌注损伤的保护作用[J].第三军医大学学报,2013,35(24):2639-2642.

[17] 张鑫雨,胡凤爱,李得志,等.黄芪对梗阻性黄疸幼鼠肝细胞TNF-α及ICAM-1表达的影响及意义[J].滨州医学院学报,2015,38(1):18-21.

[18] 富学林,李作兴,刘汉立,等.大黄与乌司他丁联用对急性呼吸窘迫综合征患者细胞间黏附分子1水平的影响[J].中国医药指南,2013,11(8):267-268.