艾灸对腹泻型肠易激综合征模型大鼠血清白细胞介素-6水平和结肠组织β-防御素-2及其mRNA表达的影响

储浩然，吴立斌，程红亮，吴生兵，蔡荣林，龙小娜，李 难，夏焕娟，吴克宇

(1.安徽中医药大学第二附属医院，安徽 合肥 230061；2.安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥 230012；3.安徽中医药大学科研实验中心，安徽 合肥 230038；4.安徽中医药大学针灸经络研究所，安徽 合肥 230038)

肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一种慢性的肠道功能疾病，并存在多种亚型，其中以腹泻型肠易激综合征(diarrhea predominant irritable bowel syndrome, D-IBS)最为常见[1]。IBS对患有该病人群的身心和经济造成了巨大压力[2-3]，这使得有关IBS的治疗与发病机制近年来一直被人们所关注，而其发病机制至今说法不一，如肠-脑轴功能紊乱、肠道炎性反应[4-5]。有研究表明，IBS发病与肠道黏膜炎性反应关系密切[6]。

对于D-IBS的治疗，现代医学目前主要以对症治疗为主。临床研究发现，艾灸疗法对于D-IBS疗效明确，且相对于现代医学的常规方法，能更大程度地缓解症状，有更高的治愈率[7]。也有动物实验证实，艾灸可促进D-IBS大鼠肠道黏膜功能修复，从而使症状缓解[8]，但其作用途径与机制仍不明确，需要进一步探究。

本研究通过观察艾灸对D-IBS大鼠血清白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)水平和结肠组织β-防御素-2(beta-defensin-2, BD-2)蛋白及其mRNA表达的影响，以IL-6、BD-2与Toll样受体-4(Toll like receptor 4,TLR4)/核因子-κB(nuclear factor kappaB，NF-κB)信号通路的关系为依据，判断艾灸天枢、上巨虚治疗D-IBS的机制是否与TLR4/NF-κB通路有关联，初步揭示艾灸抑制D-IBS炎性反应的机制。

1 材料

1.1 实验动物与分组 选取SPF级成年雄性SD大鼠30只，体质量(190±15)g，购自安徽医科大学实验动物中心，生产许可证号为SCXK(皖)2011-002。实验动物房由安徽中医药大学实验中心提供，室温(26±1)℃，湿度50%～60%，12 h明暗交替环境。大鼠适应性饲养1周后，随机选取10只作为空白对照组，另20只复制D-IBS模型。模型复制完成后，按随机数字表法分为模型组和艾灸组，每组10只。

1.2 主要试剂 IL-6 ELISA试剂盒(批号 E20170101A)：上海源叶生物科技有限公司；β-actin(批号 16AV0210)：北京中杉金桥生物科技有限公司；BD-2试剂盒(批号 AC09102356)：Bioss公司；电化学发光试剂盒(批号 QE218149)：Thermo公司；Trizol试剂(批号 101002)：Invitrogen公司；逆转录试剂盒(批号 00287813)：Thermo公司。

1.3 主要仪器 酶标仪(型号 Multiskan FC)、荧光定量PCR仪(型号PIKOREAL 96)：Thermo公司；电泳仪(型号 EPS 300)：Tanon公司。

2 方法

2.1 模型复制方法与模型评价 采用番泻叶灌胃结合局部束缚的方法复制大鼠D-IBS模型[9]。将随机选取的10只大鼠作为空白对照组，仅予以生理盐水灌胃(剂量与番泻叶水煎剂保持一致)，其余20只大鼠予以番泻叶(0.3 g/mL)灌胃。灌胃1 h后用宽透明胶带缠住大鼠上肢和肩部，限制其上肢活动，持续1 h，灌胃与束缚每日1次，持续2周。模型复制结束后通过统计并对比空白对照组(10只)与其他大鼠(20只)稀便率评价模型复制效果。即将每组大鼠分开放置于铁笼中，铁笼下放置垫有滤纸的托盘，6 h后，对各组大鼠总排便粒数和稀便数进行计数，最后计算稀便率(稀便数/总排便粒数×100%)。将各组大鼠稀便率进行统计分析比较，若稀便率较空白对照组显著升高(P<0.05)，则D-IBS模型复制成功，可进行下一步处理，若稀便率与空白对照组的差异无统计学意义(P>0.05)，则模型复制不成功，分析失败原因后重新复制模型。

2.2 干预方法 模型复制结束后对艾灸组大鼠进行干预，空白对照组与模型组不采取干预措施。选取双侧天枢、上巨虚穴进行艾灸，使用直径为0.7 cm的无烟艾条，定位参考《实验针灸学》[10]，每穴10 min，每日1次，持续1周。

2.3 大鼠结肠组织取材 大鼠使用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉后，在距离肛门8 cm左右处截取一段长度约1 cm的肠道组织，用预冷生理盐水冲洗，并用滤纸吸干后迅速放入液氮罐中保存，随后存入-80 ℃冰箱，用时取出。

2.4 观察指标与检测方法

2.4.1 ELISA法测定大鼠血清IL-6浓度 以10%水合氯醛腹腔注射将大鼠麻醉后，抽取腹主动脉血，用冷冻离心机制备血清，完成后放置于-20 ℃冰箱中储存备用。按照IL-6 ELISA试剂盒说明书步骤测定样本OD值，根据标准孔OD值和标准品浓度绘制回归曲线，将样本OD值代入回归方程中计算每组大鼠血清IL-6浓度。

2.4.2 Western blot法检测大鼠结肠组织BD-2蛋白表达 取约100 mg组织样品，加入含PMSF裂解液进行裂解，在高速冷冻离心机中12 000 r/min离心15 min后收集上清液，将稀释的待测样本及内参蛋白β-actin加入SDS-PAGE胶加样孔内，完成电泳后，依次进行转膜、封闭，按说明书进行一抗和二抗的孵育，再使用电化学发光试剂盒处理PVDF膜，胶片条带使用北京科创锐新生物凝胶成像系统进行灰度分析，最后得出每组样本BD-2蛋白相对表达水平。

2.4.3 实时荧光定量PCR测定大鼠结肠组织BD-2 mRNA的表达 按照Trizol试剂和逆转录试剂盒说明书步骤，进行大鼠结肠组织总RNA的抽提纯化和cDNA的合成。β-actin上游引物为5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游引物为5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，长度为150 bp；BD-2上游引物为5′-GTAATTAGTGGGGTTCTACT-3′，下游引物为5′-ACCACGACGACAGCGGAGAA-3′，长度为167 bp。本次实验使用相对定量实验的分析方法，计算出目的基因相对表达倍数2-ΔΔCt。

3 结果

3.1 3组大鼠血清IL-6水平比较 与空白对照组比较，模型组大鼠血清IL-6含量显著升高(P<0.05)；与模型组比较，艾灸组大鼠血清IL-6水平显著下降(P<0.05)。见图1。

注：与模型组比较，*P<0.05

3.2 3组大鼠结肠组织BD-2蛋白表达水平比较 与空白对照组比较，模型组大鼠结肠组织BD-2表达水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，艾灸组大鼠结肠组织BD-2水平显著下降(P<0.05)。见图2、图3。

注：与模型组比较，*P<0.05

3.3 3组大鼠结肠组织BD-2 mRNA表达水平比较 与空白对照组比较，模型组大鼠结肠组织BD-2 mRNA表达水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，艾灸组大鼠结肠组织BD-2 mRNA表达水平显著下降(P<0.05)。见图4。

图3 3组大鼠结肠组织BD-2蛋白表达水平

注：与模型组比较，*P<0.05

4 讨论

TLR4是一种可识别脂多糖信号并实现跨膜信号转导的受体。脂多糖信号通过D-IBS模型大鼠肠道黏膜细胞中TLR4被转导至细胞膜内，随后通过髓样分化因子88依赖途径使静息状态的NF-κB与其抑制蛋白解离并活化，NF-κB进入细胞核并诱导多种炎性因子表达，而其诱导产生的TNF-α、IL-6等炎性因子又可以激活静息状态的NF-κB，这样就形成了一系列级联反应参与的正反馈调节，炎性因子的过量表达使局部炎症不断加重，肠道黏膜结构和功能被破坏[11-12]，最终产生腹痛、腹泻等症状。BD-2广泛存在于各种多细胞生物体内，是一种天然的抗菌肽，具有抗微生物活性[13]，由NF-κB活化后进入细胞核与BD-2基因启动子区域结合诱导产生。因此，BD-2可受TLR4/NF-κB通路调节，BD-2在IBS患者结肠黏膜细胞中往往呈现高表达[14]。

D-IBS可归属于中医学“泄泻”“腹痛”等病范畴，其中不同的证候分型有不同的病机，如肝气乘脾证是由于肝失疏泄、木旺乘脾，使脾主运化功能失司，也有肾阳虚衰、脾失温煦形成的肾阳虚衰证，这些都可以导致大肠传化糟粕、主津的功能受影响，形成泄泻或腹痛。本次实验选取的天枢穴为大肠募穴，上巨虚为大肠下合穴，两者合募配用治疗腑病，可以调整大肠腑气机，止泻止痛，使其恢复正常功能。前期临床随机对照实验中，选用天枢、上巨虚配合其他辨证取穴方法治疗D-IBS，疗效确切[15]。对于该病的治疗，西医通常使用止泻剂、肠道解痉剂等药物对症治疗，中医对该病有多种治疗方法，艾灸为其中一种，通过临床实验发现，艾灸治疗D-IBS，相对于常规对症治疗，能更有效地控制症状且不易复发[16]。

本研究结果显示，艾灸天枢、上巨虚可以显著降低D-IBS模型大鼠血清IL-6和结肠组织BD-2蛋白及其mRNA的表达水平，而TLR4/NF-κB信号通路是IL-6和BD-2被诱导产生的重要途径之一，对IL-6高表达的小鼠细胞使用TLR4抑制剂(抗TLR4抗体)后，IL-6表达水平有所下降[17],BD-2蛋白及其mRNA的表达也受NF-κB抑制剂(咖啡酸苯乙酯)的影响而被抑制[18]。由此可以看出，艾灸天枢、上巨虚可能有类似于抑制TLR4/NF-κB信号通路的作用，其治疗D-IBS的过程可能是通过抑制TLR4/NF-κB通路降低IL-6以及BD-2的表达，与此同时，IL-6水平的下降本身也缓解了NF-κB激活后参与的正反馈调节，进一步使BD-2及其mRNA的表达降低，使炎性反应更有效地得到控制，促进机体恢复正常。

本研究初步探明，艾灸天枢、上巨虚对D-IBS大鼠血清IL-6水平和结肠组织BD-2的表达均有降低的作用，可能艾灸使TLR4/NF-κB信号通路受到抑制是这一作用产生的机制，但IL-6和BD-2的表达也受到TLR2介导的NF-κB或p38 MAPK信号通路等途径的影响[19-20]，所以这一推测仍需要进一步的实验去验证。本实验为临床上艾灸天枢、上巨虚治疗D-IBS提供了部分理论依据，也为今后继续探索艾灸治疗D-IBS的机制提供实验依据。

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