益气健脾通便方对慢传输型便秘大鼠Cajal间质细胞及一氧化氮、一氧化氮合酶的影响

王建民，王培森，唐 冉

(1.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031；2.安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥 230012)

慢传输型便秘(slow transit constipation，STC)是指因胃肠道功能改变，动力减弱，传导失常而导致的便秘[1]。流行病学研究显示，STC是临床常见的病症,占便秘发病率的18%～42%,约占功能性便秘发病率的45.5%[2]。其发病机制与肠神经递质、结肠肽类激素、Cajal间质细胞(Cajal interstitial cells，ICC)等密切相关。ICC是广泛存在于肠神经系统与平滑肌之间的一类极其特殊的间质细胞[3]，是胃肠道慢波的起搏细胞，对调控肠神经信号传递到效应器平滑肌细胞起着重要的作用[4]。一氧化氮(nitric oxide, NO)是肠神经系统中最重要的抑制性神经递质之一，能抑制胃肠道平滑肌的运动[5],一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)是NO合成过程中唯一的酶，而且NOS表达的增多，也可以持续性地抑制胃肠道的运动。本研究通过益气健脾通便方干预STC大鼠模型，进一步探讨其对ICC及NO、NOS的影响及其调控肠道运动的作用机制，为益气健脾通便方治疗STC提供理论依据。

1 材料

1.1 实验动物 SPF级雄性8周龄Wistar大鼠60只，体质量(200±20)g，由安徽省动物实验中心提供，生产许可证号为SCXK2012(皖)-0020，将其随机分成正常组，模型组，益气健脾通便方低、中、高剂量组，莫沙必利组，每组10只。大鼠适应性饲养1周。

1.2 药物与试剂 益气健脾通便方(白术20 g，黄芪、当归、炒枳实、党参各15 g，陈皮、杏仁各10 g，炙甘草6 g)：由安徽省中医院中药房提供，由制剂室代煎成水煎剂，含生药1.2 g/mL；枸橼酸莫沙必利片(批号 H19990317)：鲁南贝特制药有限公司；复方地芬诺酯(批号 H41023578)：中孚药业有限公司；活性炭：杭州鑫膜实业有限公司；大鼠NO、NOS试剂盒：上海双赢生物试剂有限公司；无水乙醇、二甲苯：国药集团化学试剂有限公司；柠檬酸(pH 6.0)抗原修复液、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)、胎牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)：合肥知恩生物技术有限公司。

1.3 仪器 DHP-360A型电热恒温培养箱：山东省菏泽市俊腾电子仪器有限公司；JA-21002型电子精密天平：上海双旭电子有限公司；脱水机(JJ-12J)、包埋机(JB-P5)：武汉俊杰电子有限公司；病理切片机(RM2016)：上海徕卡仪器有限公司；脱色摇床(TSY-B)、涡旋混合器(MX-F)：Servicebio；显微镜(XSP-C204)：CIC。

2 方法

2.1 模型复制方法 参照文献[6]方法，应用复方地芬诺酯混悬液灌胃复制STC大鼠模型,模型组大鼠每日给予复方地芬诺酯混悬液(8 mg/kg)灌胃1次,连续14 d。正常组大鼠以等容量生理盐水灌胃。当大鼠出现粪便量少且干时，则STC大鼠模型复制成功，停止复方地芬诺酯灌胃。

2.2 给药方法 模型复制成功后第2天开始，按大鼠用药剂量相当于60 kg成人临床用量的6倍，计算大鼠的给药剂量。益气健脾通便方低、中、高剂量组大鼠每日分别给予益气健脾通便方6、12、18 g/kg灌胃；莫沙比利组大鼠给予0.15 mg/mL莫沙比利[1.5 mg/(kg·d)]灌胃；正常组和模型组大鼠分别以等容量生理盐水灌胃。各组均连续灌胃4周。

2.3 观察指标

2.3.1 大鼠一般情况 观察各组大鼠的精神状态、活动状况、毛发光泽度、大便性状等。

2.3.2 大鼠粪便粒数及含水率检测 模型复制前1周，模型复制第2周及治疗第1、2、3、4周，每日收集各组大鼠粪便，每晚同一时间段(18:00-20:00)记录粪便颗粒数，并测定粪便含水率。使用电子精密天平称量大鼠湿粪质量，记为湿质量，将各组大鼠粪便放入80 ℃电热恒温培养箱中4 h后再称质量，记为干质量。粪便含水率为粪便湿质量与粪便干质量的差值占粪便湿质量的百分比[7]。

2.3.3 大鼠肠道传输功能检测 末次灌胃结束后，大鼠禁食不禁水24 h，用活性炭混悬液按4 mL/kg灌胃30 min后，将大鼠以颈椎脱臼法处死，随后剖腹，摘出从幽门下端至直肠末端的肠道，测量摘出肠道的长度及活性炭混悬液在肠道内的推进长度，并计算推进长度占摘出肠道长度的百分比[8]。

2.3.4 大鼠NO、NOS含量的检测 末次灌胃结束后，每组大鼠禁食不禁水24 h后，按150 mg/kg剂量给予5%水合氯醛腹腔注射麻醉，从腹腔下静脉抽取5 mL血液，4 ℃静置2 h以上，3 000 r/min离心10 min，吸取上清液，放至EP管中，封口，置-80 ℃冰箱中保存。按照比色法检测血浆NO、NOS含量。

2.3.5 大鼠结肠组织ICC检测 将大鼠麻醉后，取结肠组织，用生理盐水冲洗后置于10%中性甲醛溶液中，常规脱水，石蜡包埋，制成4 μm连续切片，石蜡切片脱蜡至水；将切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液(pH 6.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，冷却后用PBS(pH 7.4)洗涤3次；采用3%双氧水溶液阻断内源性过氧化物酶，PBS洗涤3次；在免疫组织化学圈内滴加3% BSA均匀覆盖组织，血清封闭；滴加一抗，4 ℃孵育过夜；PBS洗涤3次，在圈内滴加与一抗相应种属的二抗(HRP标记)覆盖组织，室温孵育50 min；PBS洗涤3次，DAB显色，苏木素复染细胞核，脱水封片；显微镜下检测，采用图像采集系统ImagePro-Plus 6.0进行分析，每个标本随机选取5个高倍视野(10×20倍)。以阳性细胞面积反映ICC表达量。

3 结果

3.1 大鼠粪便形态 正常组大鼠精神活泼，运动灵活，毛发光亮，进食、饮水正常，粪便颗粒大小、湿度正常；STC模型大鼠精神萎靡，皮毛无光泽，活动迟钝，粪便颗粒小而干，进食量减少，无脱肛。结果提示STC大鼠模型复制成功。

3.2 益气健脾通便方对STC大鼠粪便粒数和含水率的影响 含有一个重复测量变量的两因素方差分析结果表明，时间因素和处理因素对大鼠粪便粒数和含水率的主效应均有统计学意义(P<0.05)，两者的交互作用也均有统计学意义(P<0.05)。在模型复制前1周，各组大鼠每日粪便粒数和含水率的差异均无统计学意义(P>0.05)；模型复制第2周，模型组、莫沙必利组及益气健脾通便方低、中、高剂量组大鼠每日平均粪便粒数和含水率均明显降低，与正常组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；治疗第1、2、3、4周，除正常组和模型组外，各治疗组大鼠每日平均粪便粒数和含水率均较模型复制前1周有所上升，其中益气健脾通便方中、高剂量组疗效最为显著。见表1、表2。

3.3 益气健脾通便方对STC大鼠肠道推进率的影响 与正常组比较，模型组大鼠肠道推进率明显下降(P<0.05)；与模型组比较，莫沙必利组与益气健脾通便方低、中、高剂量组大鼠肠道推进率均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；益气健脾通便方中、高剂量组较莫沙必利组大鼠肠道推进率有一定程度升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

3.4 益气健脾通便方对STC大鼠NO、NOS表达的影响 与正常组比较，模型组大鼠NO、NOS水平均显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，莫沙必利组与益气健脾通便方低、中、高剂量组大鼠NO、NOS水平均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；益气健脾通便方高剂量组较莫沙必利组大鼠NO、NOS水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

3.5 益气健脾通便方对STC大鼠结肠组织ICC的影响 免疫组织化学染色结果显示，ICC呈现棕黄色或者棕褐色，多位于环形肌与纵行肌之间，一般以面积代表ICC细胞大小。见图1。与正常组比较，模型组大鼠结肠组织ICC面积明显降低(P<0.05)；与模型组比较，莫沙必利组，益气健脾通便方低、中、高剂量组大鼠结肠组织ICC面积显著升高(P<0.05)；与莫沙必利组比较，益气健脾通便方高剂量组大鼠结肠组织ICC面积升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表1 6组大鼠粪便粒数比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与莫沙必利组比较，△P<0.05；与中药低剂量组比较，◇P<0.05；与模型复制前1周比较，aP<0.05；与治疗第1周比较，bP<0.05；中药指益气健脾通便方

表2 6组大鼠粪便含水率比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与莫沙必利组比较，△P<0.05；与中药低剂量组比较，◇P<0.05；与模型复制前1周比较，aP<0.05；与治疗第1周比较，bP<0.05；中药指益气健脾通便方

表3 6组大鼠肠道推进率比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

表4 6组大鼠血浆NO、NOS水平比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与莫沙必利组比较，△P<0.05

4 讨论

STC为临床上常见的一种功能性肠道疾病，其发病机制尚不能完全明确，且病情顽固，治疗困难。西医在治疗上多采用促动力药及泻药，但长期服用此类药物多会产生依赖性，且对肠神经系统、胃肠激素等造成严重损害。

注：A.正常组；B.模型组；C.莫沙必利组；D.益气健脾通便方低剂量组；E.益气健脾通便方中剂量组；F.益气健脾通便方高剂量组

图1 6组大鼠结肠组织ICC表达水平比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

STC属中医学“便秘”范畴。古代文献中对便秘早有诸多记载，如《兰室秘藏·大便结燥门》谓：“若饥饱失节，劳役太甚，损伤胃气，及食辛热厚味之物，而助火邪，伏于血中，耗散真阴，津液亏少，故大便燥结。”中医学认为便秘的病因是多种因素共同构成的，外有寒热之邪，内有饮食情志失调，或久病体虚，气血阴阳亏损等。其基本病机责之为脏腑功能失调，大肠传导失司。

笔者经过几十年潜心研究，在便秘的诊断治疗过程中，全面观察患者的临床表现、舌象、脉象，形成了一套以中医理论为依据，强调辨证论治的诊治体系，注重发挥中医诊疗特色和优势。便秘的病位在大肠，与肺脾肝肾等脏腑功能失调密切相关，临床上以脾气虚导致的便秘最为常见，脾气虚衰，推动无力，肠道传导失司，糟粕停聚而发为本病。对于脾气虚型便秘，当用益气健脾、润肠通便法，拟益气健脾通便方。方中重用白术为君，意在健脾益气；党参健脾益肺，黄芪益中升清，共为臣药，助君药行健脾之效；木香行气导滞，枳实消积化滞，杏仁降气润肠，助胃肠气降，同时佐以当归、肉苁蓉温阳补血、润肠通便，陈皮理气健脾，共为佐药；炙甘草益气调和。诸药同用，共奏健脾益气、润肠通便之功。本方以补为主，以通为辅，方中大量运用益气、健脾之药，如白术、黄芪，使气旺则大肠推动有力，所谓“寓通于补之中”。中医理论认为“肺与大肠相表里”，本方运用党参补益肺气，木香、枳实、杏仁降肺通腑，肺气通调水道，布达津液于大肠，水足舟行，使大肠传导功能正常发挥，所谓“从肺治肠”。本方具有寓通于补、肺肠同治的配伍特点。

STC的发病机制可能与结肠壁内肠神经递质的异常表达相关。NO作为肠神经系统中最重要的抑制性神经递质之一，对胃肠道的动力调控具有极其重要的作用[9]。NOS是NO合成过程中唯一的酶，NOS通过催化L-精氨酸生成NO，其活性变化直接影响NO的生成量及其在血液中浓度，而且随着NOS水平的升高，胃肠道的运动也将受到持续性抑制[10]。NOS分布广泛，在胃肠壁全层均有分布，尤以平滑肌最多，NO可通过提高胃肠平滑肌内环磷酸鸟苷的浓度而导致平滑肌松驰，引起胃肠运动减弱[5]。ICC多位于环形肌与纵行肌之间，可产生电信号，通过缝隙链接传递给平滑肌细胞，引起肌层的节律性收缩，从而激发胃肠道的运动。ICC对于一些肠神经递质具有表达性，能合成、放大NO[11]。

本课题通过“复方地芬诺酯灌胃法”复制STC大鼠动物模型，观察大鼠的粪便粒数、粪便含水率、肠道推进率、NO、NOS含量及结肠组织ICC表达量。研究结果表明，益气健脾通便方能够提高STC大鼠粪便粒数、粪便含水率及肠道推进率，同时升高ICC表达量及降低NO、NOS的水平，从而改善便秘症状。益气健脾通便方改善STC的作用机制可能与ICC表达量升高及肠神经递质NO、NOS受到抑制有关。

[1] FRATTINI J C,NOGUERAS J J.Slow transit constipation:a review of a colonic functional disorder[J].Clin Colon Rectal Surg,2008,21(2):146-152.

[2] 杨向东,贺百林,贾英田.慢传输型便秘机理的研究近况[J].结直肠肛门外科,2011,17(4):264-267.

[3] LIES B,BECK K,KEPPLER J,et al.Nitrergic signalling via interstitial cells of Cajal regulates motor activity in murine colon[J].J Physiol,2015,593(20):4589-4601.

[4] STREUTKER C J,HUIZINGA J D,DRIMAN D K,et al.Interstitial cells of Cajal in health and disease: Part Ⅰ:normal ICC structure and function with associated motility disorders[J].Histopathology,2007,50(2):176-189.

[5] 孟萍,尹建康,高晓静,等.白术对慢传输型便秘大鼠结肠黏膜NO及NOS的影响[J].江西中医学院学报,2012,24(2):61-63.

[6] 朱飞叶,谢冠群,徐珊.芍药甘草汤对慢传输型便秘大鼠ICC及肠神经递质的影响[J].中华中医药杂志,2016,31(1):248-251.

[7] 王志凡,杨秀琳,陈旺盛,等.抗性淀粉对饮食诱导肥胖大鼠排便状况及肠道菌群的影响[J].动物营养学报,2016,28(5):1626-1632.

[8] 刘仍海,刘薇.温阳健脾法治疗大鼠泻药性便秘的实验研究[J].北京中医药大学学报,2013,36(9):599-602.

[9] TOMITA R,IGARASHI S,FUJISAKI S,et al.The effects of neurotensin in the colon of patients with slow transit constipation[J].Hepalogastro-enlerolog,2007,54(78): 1662-1666．

[10] 贾蕊,邢海娇,张选平,等.不同刺灸法对功能性便秘大鼠血浆一氧化氮、一氧化氮合酶及结肠血管活性肠肽的影响[J].针刺研究,2017,42(1):50-55.

[11] KOH S D,KIM T W,JUN J Y,et al.Regulation of pacemaker currents in interstitial cells of Cajal from murine small intestine by cyclic nucleotides[J].J Physiol,2000,527(1):149-162.