乌梅及其相关复方抗肿瘤机制研究进展*

钟元涛，赵远红

1.天津中医药大学研究生院(天津 300193),2.天津中医药大学第一附属医院肿瘤科(天津 300193)

乌梅性酸、涩，平，归肝、脾、肺、大肠经，具有涩肠止泻、敛肺止咳、安蛔止痛、生津止渴之功，经过历代医家的探幽发微，临床多用于久泻久利、肺虚久咳、蛔厥腹痛等寒热错杂之证，而诸多临床和实验研究也在进一步探索其对各种疾病的治疗作用。“乌药，气雄性温，故快气宣通，疏散凝滞，甚于香附。外解表而理肌，内宽中而顺气。以之散寒气，则客寒冷痛自除；驱邪气则天行疫瘴即却；开郁气，中恶腹痛，胸膈胀满，顿然可减；疏经气，中风四肢不遂，初产血气凝滞，渐次能通，皆藉其气雄之功也。” “乌药，和来气少，走泄多，但不甚刚猛，与沉香同磨作汤，治胸腹冷气，甚稳当。”“乌药，功与木香、香附同为一类，但木香苦温，入脾爽滞，用于食积则宜；香附辛苦，入肝、胆二经，开郁散结，每于忧郁则妙；此则逆邪横胸，无处不达，故用以为胸腹逆邪要药耳。”“乌药，产妇虚而胎气不顺者，切不可用，用则胎立堕。人以为顺气用之，谁知乌药能顺胎气之实，而不顺胎气之虚乎？不独胎气，凡气虚者，俱不能顺，惟血虚而带郁滞者宜之耳。” 乌药，气温，味辛，气厚味轻，入足阳明少阴经药也。诸冷能除，凡气堪顺。止翻胃，缩小便。辟疫瘴时行，解蛊毒卒中。佐香附，能治妇人诸般气症，君平胃，能消男妇诸般食积。用于风药能疏风，用于胀满能降气，用于气阻能发阻，用于腹痛能止痛。又主肾间冷气攻冲，此又为足少阴药也。然此剂无滋益人，不可多服，但取其辛散凝滞而已。"现代药理研究表明，乌梅具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗过敏、抗惊厥、抗氧化、解毒、镇咳等作用。尤其是在肿瘤治疗的临床应用和实验研究中有很多亮点，近年来乌梅及其相关中药复方的抗肿瘤临床运用和报道渐增，其抗肿瘤机理也引起广大学者关注和积极研究。肿瘤的治疗是临床的难题，现代医学认为，肿瘤细胞具有基因组不稳定和突变、抵抗细胞凋亡、无限的复制能力、持续的血管生成、组织浸润和转移、自给自足的生长信号、抗生长信号的不敏感、逃避免疫摧毁、促进肿瘤炎症和细胞能量代谢异常等十大特征，对肿瘤细胞特征的深入了解也为中药抗肿瘤机制的研究提供了新的思路和方法。结合肿瘤细胞的特性，对乌梅、乌梅提取物及其相关中药复方抗肿瘤机制研究从细胞、蛋白、基因等各个层次不断取得突破，乌梅可以从多方位、多靶点在肿瘤的治疗中发挥积极作用，且看到了新型抗肿瘤药物临床推广的可能，以下阐述近年中药乌梅及其相关复方抗肿瘤机制研究，为进一步开展乌梅及其相关复方抗肿瘤机制的研究及临床运用提供科学依据。

1 防止癌肿转化

细胞癌变是一个渐进过程，很多肿瘤的发生是因正常细胞在炎症、病理因素的等刺激下出现异常生长，导致细胞增殖异常，最终发展成具有无限增殖能力的肿瘤，诸如肠道慢性炎症、Barrett食管等被认为是癌前病变，而对癌前病变的防治可以在一定程度上防止某些肿瘤的发生。徐超等[1]通过AOM-DSS诱导的肠病癌变小鼠，用乌梅提取物进行干预，研究乌梅提取物对AOM-DSS诱导的肠病癌变小鼠体重、疾病活动指数(DAI)、小鼠结肠重量/长度比值的变化和小鼠肠道肿瘤的形成情况。结果发现，乌梅具有预防肠道炎症癌转化的作用，能够有效防止AOM-DSS诱导的肠病癌变。李应杰[2]运用乌梅汤联合内镜下氩离子凝固术治疗Barrett食管，发现相对于单纯接受手术的患者，联合乌梅汤可以使患者拥有更好的近期疗效，乌梅汤可以通过对食管黏膜的保护和修复，促进患者康复，防止癌变。

2 减少致癌基因表达

癌症发生的根本原因是致癌基因的激活表达、端粒酶活性增加，导致细胞的无限增殖，抑制原癌基因的表达和端粒酶的活性可以在一定程度上发挥抗肿瘤作用。致癌基因分为几个类群，分别代表从跨膜蛋白质到转录因子的不同活性类型，其功能的确定可能会解释肿瘤形成种许多类型的变化。一个癌基因的产生代表一种功能的获得，其中细胞原癌基因被异常激活。这可能是蛋白质或组成活性发生了变异、过量表达或适当时候停止表达。狭义的致癌基因是指形成与细胞癌化有直接关系的蛋白质的基因。其典型的为肉瘤基因，在具有强烈致癌性的肿瘤病毒中发现了与细胞的癌化有关、但与病毒的增殖无关的数种肉瘤基因。另外从引起急性白血病的肿瘤病毒中发现数种急性白血病基因。这些致癌基因，已陆续证实都由正常细胞中存在的基因转变而来。从与正常细胞中的致癌基因对应的基因，在多种动物中广泛地存在着，认为它们对动物的生命来说还是有用的。关于癌肿的基因还未发现。上述肉瘤和急性白血病基因加上腺病毒的Ela、Elb区域，以及乳多空病毒的初期基因区域等，虽非来源于细胞的基因，但含有使细胞致癌的基因，属于广义的致癌基因，也称为转化基因。李勇等[3-4]研究乌梅丸对大鼠胃黏膜癌变模型干预作用，造模成功后随机分为模型组、高、低剂量乌梅丸组进行干预，运用TRAP-ELISA方法检测大鼠胃黏膜端粒酶活性和检测细胞核抗原(PCNA)的表达。结果乌梅丸能使端粒酶活性和PCNA的表达下降，降低大鼠胃黏膜癌变模型的癌变和异常增生几率，且高剂量组效果更佳(P<0.05)。乌梅丸对人胃癌细胞作用的体外实验表明，其抑制肿瘤的机制与乌梅丸抑制致癌基因c-myc、survivin表达有关。张力等[5]运用MTT法，观察不同浓度的复方乌梅散(乌梅、五味子)、五味子、乌梅体外对胃癌细胞株MGC-803增殖及粘附能力的影响,结果发现，各个浓度的复方乌梅散、乌梅、五味子水提液对体外培养的MGC-803细胞的增殖和黏附能力有不同程度的抑制作用，且复方乌梅散有更好的效果；复方乌梅散可以下调裸鼠皮下移植瘤的CXCR4、HIF-1α、VEGFA-224基因的表达，并有一定的浓度依赖性。

3 调节蛋白及信号通路

细胞内各种不同的生化反应途径都是由一系列不同的蛋白组成的，执行着不同的生理生化功能。各个信号通路中上游蛋白对下游蛋白活性的调节(包括激活或抑制作用)主要是通过添加或去除磷酸基团，从而改变下游蛋白的立体构象完成的。所以，构成信号通路的主要成员是蛋白激酶和磷酸酶，它们能够快速改变和恢复下游蛋白的构象。从细胞受体接收外界信号到最后做出综合性应答，不仅是一个信号转导过程，更重要的是将外界信号进行逐步放大的过程。受体蛋白将细胞外信号转变为细胞内信号，经信号级联放大、分散和调节，最终产生一系列综合性的细胞应答，包括下游基因表达的调节、细胞内酶活性的变化、细胞骨架构型和DNA合成的改变等(如图3)。这些变化并非都是由一种信号引起的，也可以通过几种信号的不同组合产生不同的反应。肿瘤细胞的生长和凋亡受到多种蛋白及信号通路的调控，如Fas/FasL信号通路的高表达可以激活肿瘤细胞的内源性凋亡途径，而ERK通路的高表达可以促进肿瘤细胞的增殖[6]。王萍等[7]运用小鼠乳腺癌4T1细胞接种建立原位移植瘤模型，并用免疫组化方法，研究乌梅丸及其拆方对小鼠乳腺癌的肿瘤细胞凋亡相关因子Fas、FasL的影响，结果发现乌梅丸全方有更强的抑制肿瘤增殖的作用，其机制可能为促进Fas、FasL分子的表达。赵伟鹏等[8]采用蛋白组学方法研究加味乌梅丸(乌梅、当归、细辛、川椒、桂枝、黄连、黄柏、党参、干姜、制附片、白芍、生黄芪、壁虎、炒枳壳、木香)治疗胰腺癌的分子机制，用非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠接种人胰腺癌SW990细胞建立胰腺癌移植瘤模型，并予加味乌梅丸制剂灌胃治疗，结果加味乌梅丸可以通过下调肌桨球蛋白调节轻链2 (mlCII)、碳酸酐酶3(CAⅢ)、肌浆/内质网钙ATP酶(ATPase)、脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(FABP4)4个蛋白的表达，并上调硒结合蛋白(selenoprotein)、高迁移率蛋白17的表达来发挥抗肿瘤作用。

KTada[9]等发现，乌梅提取物MK615可以抑制人皮肤黑色素瘤细胞A375的生长，其主要作用机制是抑制ERK1/2的磷酸化，从而降低mRNA和DNA结合因子1(Id-1)的表达，发挥抗肿瘤作用。熊果酸是从乌梅中提取的天然五环三萜类化合物，具有抗肿瘤效应，用熊果酸干预MCF-7(ER+，PR+/-，HER2-)，MDA-MB-231(ER-，PR-，HER2-)和SK-BR-3(ER-，PR-，HER2+)三种不同受体状态的乳腺癌细胞，发现熊果酸可以降低AKT信号的作用、增强AMPK的活性，从而促进细胞毒性自噬和凋亡[10]。通过蛋白质印迹法观察熊果酸干预体外培养的结肠直肠癌细胞发现，ATP5B/CALR/HSP90B1/HSPB1/HSPD1信号通路是其调节多种蛋白功能的关键[11]。Song B[12]等的研究发现，熊果酸可以增强抗辐射细胞系H1299/M-HIF-1α细胞的放疗敏感性，其作用机制为减少内源性谷胱甘肽的合成和降低缺氧诱导因子HIF-1α的表达有关。

4 诱导细胞凋亡

肿瘤细胞的内源性凋亡机制可以在某些药物的作用下增强。赵伟鹏等[13]研究加味乌梅丸(乌梅、当归、细辛、川椒、桂枝、黄连、黄柏、党参、干姜、制附片、白芍、生黄芪、壁虎、炒枳壳、木香)对小鼠胰腺癌移植瘤细胞凋亡的影响，胰腺癌sw1990细胞NOD-SCID小鼠造模成功后均分两组，用药组灌胃加味乌梅丸水煎剂，对照组予无菌注射用水，应用流式法检测癌细胞凋亡率，TUNEL染色观察细胞凋亡，并观察细胞形态学改变，结果用药组的凋亡指数高于对照组，并有大量典型的凋亡小体出现。而运用比较蛋白组学的方法研究加味乌梅丸抑制SW1990细胞移植瘤的实验研究表明，加味乌梅丸发挥抗瘤作用很可能是诱导胰腺癌细胞早期调亡而实现的，其作用机制是使肌浆球蛋白调节轻链2、肌质、肌浆/内质网钙ATP酶、碳酸酐酶3，脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白4个差异蛋白表达下调，并上调结合蛋白、高迁移率蛋白17这表达发挥抗肿瘤作用[14]。ParkC等[15]研究发现，乌梅醇提物对人白血病U937细胞有浓度依赖性的促凋亡作用，其促凋亡作用与激活U937细胞内的半胱天冬酶途径和阻止细胞外的半胱天冬酶3介导的受体途径有关。

5 抑制增殖转移

无限复制和侵袭转移是肿瘤的重要特征，肿瘤细胞的增殖和转移能力是评估其恶性程度的标准等。肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞从原发部位，经淋巴道， 血管或体腔等途径，到达其他部位继续生长的这一过程。恶性肿瘤的这种特性，应该称为扩散。恶性肿瘤的转移往往是肿瘤治疗失败的主要原因。良性肿瘤无转移。恶性肿瘤容易发生转移，其方式有四种：直接蔓延到邻近部位；淋巴转移:原发癌的细胞随淋巴引流，由近及远转移到各级淋巴结，也可能超级转移;或因癌阻碍顺行的淋巴引流而发生逆向转移。转移癌在淋巴结发展时，淋巴结肿大且变硬，起初尚可活动，癌侵越包膜后趋向固定，转移癌阻碍局部组织淋巴引流，可能引起皮肤、皮下或肢体的淋巴水肿；血行转移:癌细胞进入血管随血流转移至远隔部位如肺、肝、骨、脑等处，形成继发性肿瘤；种植:瘤细胞脱落后种植到另一部位，如内脏的癌播种到腹膜或胸膜上。显然，恶性肿瘤转移将增加对机体的损害作用，而且影响转归。王琼[16]用不同浓度的乌梅黄连复方(乌梅、黄连、细辛、冰片)干预对数生长期的体外培养HT29细胞，结果表明，乌梅黄连复方能抑制HT29细胞的增殖和PA诱导的HT29细胞的迁移(P<0.01)，并有一定的浓度依赖性。朱萱萱等[17]运用乌梅黄连复方干预处于对数生长期的结肠癌细胞株Lovo细胞和HT29细胞，结果发现，乌梅黄连复方可以抑制HT29细胞的增殖，并且对处于对数生长期的Lovo细胞的增殖亦有抑制作用，且呈浓度依赖性。肿瘤的转移与肿瘤细胞的粘附、侵袭能力密切相关，周锦勇等[18]通过研究发现，复方乌梅散(乌梅：五味子=1：1)可以抑制体外培养的胃癌MGC-803细胞的黏附、迁徙、侵袭能力，而且该作用呈一定的浓度依赖性。孙静等[19]观察乌梅等中药对小鼠肝癌淋巴转移的影响，采用内侧皮下注射接种腹水型肝癌H22瘤株建立淋巴道转移模型，分别予生理盐水和一定浓度的参一胶囊、椿皮、乌梅、山茱萸等灌肠，结果与空白对照组和生理盐水组相比，乌梅和山茱萸可以明显减少肺转移结节,抑瘤率明显增加(P<0.05)。T Hoshino等[20]发现，乌梅提取物MK615具有抗多种肿瘤的作用，在一例肝癌术后复发伴淋巴结和肺转移的病例中，患者口服索拉非尼治疗，病情未得到有效控制，运用MK615治疗3个月后，转移灶均减小，并且甲胎蛋白水平也下降，随诊17个月患者依然存活。

6 控制肿瘤体积

实体瘤的体积是评估预后独立因素，瘤体越大，宿主肿瘤负荷越重，对放化疗等治疗的敏感度也会受到影响。邹玺等[21]观察复方乌梅散(乌梅、五味子)各种剂型对H22荷瘤小鼠的抑瘤率和生存期影响，结果复方乌梅散超微粉碎组、水提液组、醇提液组肿瘤抑制率分别为34.44%、27.08%、33.05%，说明复方醇提液、复方超微粉碎剂可以有效抑制肿瘤的增长。郭继龙等[22]研究5种收涩中药对小鼠S180肉瘤抑制作用，实验动物接种肿瘤造模成功后随机分为空白对照组、乌梅组、椿皮组、五倍子组、五味子组、金樱子组、环磷酰胺组7组，分别予相应的药物灌胃，结果与空白对照组比较，乌梅组、椿皮组、环磷酰胺组抑瘤作用较强(P<0.05)，且与空白对照组比较，乌梅组、椿皮组及环磷酰胺组核面积、形状因子及异形指数均降低(P<0.05)。而陈奎利等[23]的研究表明，乌梅提取物熊果酸也能抑制瘤体增长，其作用可能是通过调节凋亡相关蛋白(Caspase-3、bcl‐2、Bax)表达来实现的。

7 小结与展望

中医古籍早有乌梅抗肿瘤作用的记载，《神农本草经》云：“乌梅味酸平，主下气，除热，烦满，安心，肢体痛，偏枯不仁，死肌，去青黑痣，恶疾。”《刘涓子鬼遗方》载用乌梅肉烧存性，研敷恶肉上，一夜立尽。分析实验研究结果可知，中药乌梅及其相关复方可以从抑制癌前病变、调节基因的表达、影响蛋白的活性及信号通路的表达、抑制肿瘤细胞的增殖转移、促进肿瘤细胞的凋亡等多方面发挥抗肿瘤作用。其相关中药复方与单药相比较在抗肿瘤方面有更大的优势，为临床运用提供了借鉴。对乌梅及相关复方提取物抗瘤机制的研究让我们看到了其提取物发展成新一代抗癌药物的希望，尤其是乌梅提取物熊果酸、MK615在抑制肿瘤细胞生长和促进其凋亡方面体现出很好的效果，亦有相关文献报道其临床治疗肿瘤的个案，其作用主要通过调节信号蛋白的表达实现，但仍需要进一步的实验研究阐明其作用机制，为临床实验提供更多的依据，在提取工艺上也需进一步创新和规范，以期在保证抗癌效果的同时兼顾临床应用的可行性和安全性。通过分析发现，既往文献报道中的研究方法和实验设计大多有一定程度的缺陷，无法成为临床运用有效的证据。乌梅作为传统的中药，在扩大其临床适应症的同时应兼顾中医特色的体现，而大多数实验研究对乌梅及其中药复方抗肿瘤功效与中医辨证思维缺乏紧密联系，有待进一步提升实验的严谨性，而明确各种抑瘤机制之间的联合作用及相对应的中医机制的关系，还需要进行更深层次的研究和分析。迄今为止使用中药乌梅及其复方提取物证实在胃肠道肿瘤新生血管方面的研究非常少见，其诱导癌细胞免疫耐受的研究也乏善可陈，希望通过严谨的实验设计和先进的研究方法，挖掘证实乌梅及其相关提取物在肿瘤尤其对消化道肿瘤抑制与防治作用，为消化道肿瘤的治疗提供客观、科学并有价值的选择，真正再现中西医结合的魅力。

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