DNA甲基化与动脉粥样硬化关系的研究进展

郭丹,刘丹,张广炜(内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院,内蒙古包头014010)

动脉粥样硬化(AS)是心脑血管疾病中常见基础疾病，在发达中国家AS性心脑血管疾病已经成为致死致残的主要疾病，同时在发展中国家也处于上升趋势[1]。AS的主要病理变化有脂质沉积于动脉内膜、粥样斑块形成引起管腔狭窄，管壁变硬，从而使相应组织出现缺血性改变。目前已知的AS发病机制有损伤-应答反应学说、脂质渗入学说、动脉平滑肌增殖或突变学说、慢性炎症学说等[2]。而损伤-应答学说是AS形成的第一步，同时也是心脑血管事件的早期征兆，主要是由于反复的机械性或毒性作用使动脉内膜损伤，最终导致低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)通过破损内皮细胞进入到内皮下间隙，同时单核细胞进入内膜形成巨噬细胞。其外部的清道夫受体与氧化的低密度脂蛋白胆固醇(ox-LDL)结合并被摄取，形成泡沫细胞。来自动脉中膜的平滑肌细胞迁入内膜吞噬脂质形成肌源性泡沫细胞,进而形成纤维帽。而ox-LDL使上述形成的泡沫细胞坏死崩解形成粥样坏死物即粥样斑块。AS形成的危险因素分为可变因素和不可变因素，可变因素有糖尿病、高血压、脂质代谢紊乱、不良生活习惯(吸烟、缺乏锻炼等)，不可变因素主要有年龄、性别、种族等，而可变因素的形成是由于基因的改变而导致基因表达产物发生变化所形成的，并且基因组DNA甲基化的改变是当前基因组学研究的热点。本文就DNA甲基化与AS关系的研究进展进行如下综述。

1 DNA及其甲基化

DNA是生命遗传的物质基础，为基因的复制和转录提供了模板。它的基本组成单位是脱氧核糖核酸，而脱氧核糖核酸是由磷酸、脱氧核糖、碱基(嘌呤和嘧啶)组成，相邻两个脱氧核糖核酸之间通过缩合作用形成了含有3′，5′-磷酸二酯键的脱氧核苷酸链，即DNA的一级结构；而每两条脱氧核苷酸链通过碱基之间的氢键互补配对形成了DNA的双螺旋结构，即DNA的二级结构；DNA的二级结构经过多次的折叠盘绕形成DNA的超螺旋结构，即DNA的高级结构。DNA经过转录和翻译形成蛋白质，在此过程中，对DNA碱基或组蛋白进行化学修饰将会影响基因的表达，进而产生不同的生物学效应。其中研究最多的是DNA的甲基化修饰。

DNA甲基化是最早发现的化学修饰途径之一，它涉及基因的表达、mRNA的拼接和基因组的稳定性，并且受环境因素、年龄、性别及基因变异的影响，形成过程是由S-腺苷甲硫氨酸提供甲基，经过DNA甲基转移酶(DNMTs)的催化形成5-甲基胞嘧啶，此过程主要发生于基因的胞嘧啶-鸟嘌呤(CpG)双核苷酸序列[3]，并且可以通过DNA的复制而遗传。在人类和啮齿类动物中位于基因启动子区中的CpG具有高度保守性，且多数呈现非甲基化状态[4]。而启动子区DNA的甲基化是抑制基因表达最常见的表观遗传现象之一，启动子区序列发生甲基化改变后，甲基基团本身以及甲基化DNA募集的结合蛋白造成空间位阻，会抑制其与转录因子结合，最终影响基因表达,而基因-环境相互作用在AS的形成过程中起着重要作用[5]。因此，熟知DNA甲基化的作用对于了解疾病的过程及治疗至关重要。

DNA甲基化是由从头甲基化和维持甲基化两部分组成，这两个过程都需要特定的DNMTs催化。DNMTs是一种主要在大脑中存在的酶，并且在基因表观遗传学上起着重要的调节作用[6]。目前为止，在哺乳动物中有6种不同的DNMTs,分别为DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3C和DNMT3L。DNMT1对DNA甲基化有重要作用[7]，同时具有修复DNA甲基化的能力。DNMT2实际上是在天门冬氨酸转运RNA的反密码子环胞嘧啶38位中加入甲基，它的实质并不是基因组DNA的甲基转移酶[8]。DNMT3a和DNMT3b通常出现在富含CpG岛的未甲基化DNA链中[9]，主要的功能是对未行甲基化的DNA链进行甲基化修饰。DNMT3C可以保护男性生殖细胞不受逆转录活动的影响[10]，它是新发现的一种甲基转移酶。DNMT3L没有任何催化作用，但可以诱导DNMT3a和DNMT3b的活性，从而间接地促成DNA甲基化的改变。

国内外大量研究已经确定，许多机制可通过影响DNA甲基化引起AS发生发展，这些机制主要包括促进肌动蛋白、内皮功能障碍，平滑肌细胞或单核巨噬细胞的增殖和迁移，细胞外基质的生成等[11]。然而，考虑到AS的动态性质和组织非均匀性，确定DNA甲基化在AS发病机制中的确切作用仍具有挑战性。

2 AS相关基因的甲基化

2.1 同型半胱氨酸(Hcy) Hcy是最早发现的致AS因子，是甲硫氨酸循环的中间产物，并且是AS形成的独立危险因素。Hcy水平升高引起AS主要有以下原因：内皮细胞受损和功能障碍使得自由基氧化形成活性氧、脂代谢紊乱、血栓形成,激活单核细胞，使血管平滑肌细胞增殖。目前有研究表明，高同型半胱氨酸血症可引起DNA甲基化修饰而促进AS形成[12]。

2.2 雌激素受体基因(ERa) 正常生理条件下，雌激素通过与循环系统中的ERa相结合起到保护循环系统的作用，雌激素与ER结合可以促进一氧化氮产生。在AS的形成过程中，ERa启动子CpG岛的异常高甲基化改变,将使ERa表达受到抑制,导致平滑肌细胞中ERa数目大量减少,最终减弱雌激素对心血管的保护作用。患有AS的绝经前女性ER的表达是显著降低的。提示由于基因甲基化状态的改变所导致的ER基因沉默可能抵消了雌激素的保护作用。

2.3 单羧酸转运蛋白(MCTs) 近年研究表明，MCTs的主要功能是协助乳酸转运出细胞。Zhu等[13]研究表明，AS病变的严重程度与MCT3第二外显子区CpG岛甲基化改变有关。收缩型平滑肌细胞中MCT3的表达水平高于合成型平滑肌细胞，进而使得乳酸的转运受到影响，给予甲基化抑制剂后受损的乳酸转运可以被逆转，从而说明MCT3经过甲基化修饰之后，可以影响其表达和平滑肌细胞的功能，从而影响AS的发生发展。

2.4 组织因子途径抑制物2(TFPI-2)甲基化 TFPI-2是基质金属蛋白酶(MMPs)活性的内源性抑制物，主要分布于内皮细胞和成纤维细胞的细胞外基质中，有抑制凝血、纤维溶解，调控平滑肌细胞和单核/巨噬细胞增殖的功能。Zawadzki等[14]通过大量研究表明，随着AS进展，可能伴随有TFPI-2基因的甲基化修饰，进而影响其表达，最终使得斑块迅猛发展，显著降低了斑块的稳定性。

2.5 细胞外超氧化物歧化酶(EC-SOD)基因甲基化 超氧化物歧化酶(SOD)是一种来源于生命体的活性物质，可以抑制超氧化物及其反应产物的活性，同时也能够清除生物体在新陈代谢中所形成的有害物质。近年研究表明，EC-SOD甲基化程度升高，将导致EC-SOD表达降低，使得机体抗氧化反应减弱，最终形成AS。Laukkanen等[15]通过一系列研究表明，5′端CpG甲基化状态改变与EC-SOD表达改变没有直接的因果关系，但认为该基因的低甲基化可影响平滑肌细胞的增殖，在AS发生过程中有一定的作用，但具体作用机制需进一步研究。

2.6 p53基因甲基化 p53是人类的抑癌基因之一，是细胞增殖和凋亡的重要分子。Guevara等[16]发现，在APOE-/-小鼠中，p53基因表达被抑制(p53-/-)的小鼠发生AS的程度更大。但是迄今为止，p53基因启动子区甲基化引起AS的机制并不十分清楚。

2.7 TET2甲基化 TET2是TET家族(包括TET1、TET2、TET3)中的一员[17]，是与造血系统密切相关的肿瘤抑制基因。近年根据Calkin等[18]的实验发现，TET2甲基化也是AS的危险因素之一。

3 AS危险因素与DNA甲基化

3.1 脂代谢紊乱 脂代谢紊乱是AS的危险因素之一，有效地干预脂代谢紊乱对心脑血管疾病有益[19]，且贯穿于疾病的始终。已有研究表明，脂代谢紊乱不仅可使脂质在局部组织中沉积，也会使巨噬细胞聚集导致泡沫细胞形成；同时也可使局部组织发生炎症反应，引起氧化应激反应，使血管内皮细胞的功能受到影响，血管通透性增加，从而参与AS的发生与发展。脂代谢紊乱主要指血浆中的TC和(或)TG、LDL-C、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)中的一项或多项异常。大量资料表明，LDL-C升高与AS严重程度呈正相关[20]，而HDL-C有抗AS的作用。

目前，已知三磷酸腺苷结合盒转运体G1(ABCG1)、N-乙酰氨基半乳糖转移酶(GALNT2)、β-羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)与脂质代谢有紧密联系，并且这些基因启动子区的甲基化将对AS的形成起至关重要作用。ABCG1是ABCG家族的一种跨膜半转运体，在肺、胸腺、肾上腺、脑、脾和巨噬细胞高表达,可参与巨噬细胞胆固醇逆转运的中间过程，防止过量的脂质积累，从而防止AS[21]。Pfeiffer等[22]研究表明，ABCG1基因启动子区甲基化的改变与HDL-C呈相反关系。因此可以通过改变甲基化的状态调节脂代谢紊乱，从而减缓AS形成。

目前多个全基因组关联分析(GWAS)证实，GALNT2与HDL-C及TC存在密切相关性，可能是由于GALNT2修饰载脂蛋白及载脂蛋白受体，进而引起脂质水平改变。由于DNA甲基化通常与基因沉默有关，GALNT2甲基化能够增加TG含量、降低HDL-C,进而促进AS形成。HMGCR是胆固醇合成的限速酶，它不仅可以改变代谢途径的总速度，还可以决定代谢的方向，是胆固醇反馈抑制中重要的调控位点[23]。HMGCR基因启动子区甲基化会使HMGCR表达沉默从而减少胆固醇合成，在一定程度上降低血脂，减缓AS进程。

3.2 原发性高血压 原发性高血压是由遗传与环境因素共同作用引起以血压升高为主要临床表现的一种疾病。近年研究表明，代谢酶基因如11β-类固醇脱氢酶-2、内皮素转换酶1，受体基因如血管紧张素Ⅱ受体1型b亚型等基因发生甲基化和去甲基化能够影响代谢酶和受体的表达，进而通过肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活以及肾性水钠潴留等引起高血压的发生发展。

3.3 糖尿病 2型糖尿病(T2DM)是多种环境因素和遗传因素共同作用而引起的外周血血糖升高的一种内分泌系统疾病。Michael等[24]对人类胰岛细胞进行了DNA甲基化检测，发现254个基因中有276个CpG位点的甲基化改变与T2DM有关。

3.4 年龄 随着年龄的不断增长，DNMTs也会发生变化，但这种变化是复杂的且不稳定,将对DNA甲基化产生影响。大量研究表明，胚胎生长促进因子、周期依赖性激酶阻滞因子[25]、ER基因、E钙粘连蛋白、N33基因随着年龄的增长而发生高甲基化改变。随着DNA甲基化和年龄相关性研究的不断深入,可以明确两者的关系,减缓AS的形成。

此外,还有研究表明不良的饮食及生活习惯，如吸烟、运动量减少、高脂饮食等都可以引起DNA甲基化的改变，这些均可以影响AS的发生发展。DNA甲基化改变是一种可遗传的化学性共价修饰，化学性质稳定。DNA去甲基化存在主动去甲基化与被动去甲基化两种途径，目前对于DNA去甲基化主要集中于肿瘤细胞的研究，尚缺乏充足的研究表明DNA去甲基化与AS之间的相关性，DNA去甲基化是否可以逆转AS的发生发展，需要未来基因组学方面的相关研究。

综上所述,Hcy、ER、MCTs、TFPI-2、TET2、ABCG1、GALNT2启动子区DNA甲基化会加剧AS，而HMGCR的甲基化则会减少胆固醇的形成，降低血脂水平，从而在一定程度上缓解AS的形成，但是EC-SOD和p53基因甲基化与AS之间的相关性研究还不明确。随着科学技术的进步，对AS的研究已经取得了重大突破，而对于基因组DNA甲基化与AS相关性的研究才刚起步，随着对DNA甲基化认识的逐步完善，以及对AS相关危险因素的研究使得对AS的形成机制越来越清晰，为预防和缓解AS提供更多新的作用靶点，将有利于AS疾病的预防与治疗。