LY294002通过PI3K/Akt/mTOR对CD133+CD44+结直肠癌干细胞自我更新、增殖能力的影响

伊纪瑛，唐晨曦，章淑芳，李孝琼，陈政儒，李佳丽，夏金蓉，李思宇，冷政伟

(1.南充市中心医院肿瘤科；2.川北医学院肝胆胰肠疾病研究所，四川 南充 637000)

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)发病率和死亡率在我国恶性肿瘤中排名第五；在美国已跃居第三，居消化系统肿瘤第一位；CRC患者中40%～50%在初诊时已有远处转移，即使接受了根治性手术切除和规范放化疗，最终仍然有50%以上转移复发，肿瘤耐药、转移复发是CRC的主要死因[1-2]。研究证实，能够耐受治疗的细胞由肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)组成，CSCs数量十分稀少甚至无法检测，但其强大的自我更新、增殖能力最终介导了肿瘤的转移复发，因此，CSCs已经成为探索治疗肿瘤最重要的靶点之一[3-5]。科学家主要通过标记CD133、CD44、CD166、EpCAM、Lgr5、ALDH、SP等标识来分析分选CRC-CSCs[6]。PI3K/Akt/mTOR通路激活后具有促进细胞增殖、抗凋亡、促进血管生成及转移作用，已经成为肿瘤研究的热点，但PI3K/Akt/mTOR通路在维持CRC-CSCs自我更新、增殖过程中的作用未见报道。本课题首先分选CD133+CD44+的CRC-CSCs，将PI3K/Akt/mTOR通路抑制剂作用于CSCs，以研究此通路在人CRC-CSCs自我更新、增殖过程中的作用及机制。

1 材料和方法

1.1 材料

人结直肠癌HCT116细胞系、McCoy’s 5A培养基均购自美国模式菌种收集中心(ATCC)；胎牛血清(FBS)及DMEM/F12培养基购自美国Hyclone公司；LY394002、牛血清白蛋白(BSA)、7-AAD、B27及胰岛素购自美国Sigma公司；人表皮细胞生长因子(EGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)购自美国Pepro-Tech公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁化工公司；PI3K/Akt/mTOR通路一抗及二抗均购自美国Santa Cruz公司；CD133-PE及CD44-FITC流式细胞术(FCM)抗体及相关试剂购自德国美天妮公司；转录因子流式细胞术检测试剂盒购自美国BD公司。

1.2 结直肠癌CD133+CD44+肿瘤干细胞分选

人结直肠癌HCT116细胞用含10% FBS的McCoy’s 5A培养基培养于37 ℃ 5%CO2细胞培养箱中。常规消化细胞，悬浮1×106细胞于100 μL 缓冲液中，分别加入3 μL CD133-PE及CD44-FITC抗体，4 ℃避光孵育30min，上机前7-AAD室温孵育10min以利分选时去除死细胞，然后上机分选(BD FACSAria Fusion)，分选获得CD133+CD44+及CD133-CD44-细胞，细胞分别培养于含20 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF、5 μg/mL 胰岛素、0.4% BSA及2% B27的无血清DMEM/F12培养基中，然后进行CD133+CD44+细胞CSCs特征鉴定，细胞培养箱中培养2 d后进行后续实验。

1.3 细胞活性计数法检测LY294002对CSCs增殖能力的影响

细胞活性计数法(CCK-8)：取5×103细胞/孔接种于96孔板中，实验组用LY294002(10、20、30 μmol/L)、对照组不使用LY294002，细胞培养箱中培养3 d后加入CCK-8试剂，在450 nm波长处读吸光度值(OD)，绘制生长曲线，抑制率(%)=(1-OD实验组/OD对照组×100%)。

1.4 成球实验、细胞周期检测及平板克隆实验

实验流程参考本课题组发表论文[7]，成球实验及平板克隆实验中接种5×103细胞于相应6孔板中，2周后收集数据行统计学分析。

1.5 有限浓度稀释法

细胞以每孔不同浓度(0.5、1、1.5、2个细胞/孔)接种于96孔板中培养2 周后记录每孔中细胞球数量，阴性孔比例与细胞稀释浓度作图并进行线性回归分析，计算CSCs比例[8]。

1.6 实时定量PCR检测PI3K/Akt/mTOR通路基因mRNA表达

实验步骤参考课题组发表论文[7]，引物序列如下：

GAPDH-F：5′-GGGGAGCCAAAAGGGTCATCATCT-3′，

GAPDH-R：5′ GACGCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′；

CyclinD1-F：5′-TACCGCACAACGCACTTTC-3′，

CyclinD1-R：5′-AAGGGCTTCAATCTGTTCCTG-3′；

mTOR-F：5′-CGCTGCCCCTTTATCG-3′，

mTOR-R：5′-GGTGGAGGTGTTTGAGCAT-3′；

Bcl-2-F：5′-GTGAGAAGTGAGGGACCTTTATG-3′，

Bcl-2-R：5′-CACTCATTAGCCATATCCAACTTG-3′；

DcR3-F：5′-TTCTGCTTGGAGCACGCATCG-3′，

DcR3-R：5′-ACGCAGCTTCAGCTGCAAGG-3′。

1.7 FCM检测PI3K/Akt/mTOR通路蛋白质表达

按照BD流式细胞术转录因子检测试剂盒说明书在室温下作用40 min以固定及通透3×105细胞，1/100稀释的一抗在4 ℃避光作用4 h，漂洗后以1/100稀释的荧光素标记二抗37 ℃作用30 min，不加一抗只加入二抗组设置为流式细胞术同型对照，漂洗后细胞悬浮于200 μL 孵育液中上机检测。FCM数据采用FlowJo version 10.0分析，蛋白质相对表达量多少由荧光强度比(RFI)大小表示，RFI=样本平均荧光强度/同型对照平均荧光强度[9-10]。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 CD133+CD44+肿瘤干细胞特征的鉴定

成球实验是CSCs体外鉴定的一个重要方法，检测细胞自我更新能力。成球实验数据显示：CD133+CD44+与CD133-CD44-细胞成球数量分别为375±16.82，11±4.58(t=36.16，P<0.01)，提示CD133+CD44+可以作为CRC-CSCs的研究模型。

2.2 LY294002对CSCs增殖能力的影响

CCK-8数据显示，CSCs增殖能力随LY294002浓度及作用时间增加而逐渐削弱，30 μmol/L LY294002组作用3 d后，CSCs增殖抑制率为(53.9±4.12)%，根据实验结果取30 μmol/L组作为实验组进行后续实验。

与CCK-8数据相吻合，实验组与对照组体外克隆数分别为25.67±4.16，390.67±17.01，(t=36.10，P<0.01)，以上数据显示，LY294002对CSCs的增殖具有明显的抑制作用。

2.3 LY294002对CSCs自我更新能力的影响

成球实验显示，实验组与对照组细胞球数量分别为15.67±4.04，370±17.69，(t=33.82，P<0.01)；LDA实验显示，实验组与对照组CSCs比例分别为(12.75±2.04)%，(66.02±2.47)%，(t=28.77，P<0.01)；以上数据提示实验组CSCs自我更新能力受到明显削弱。

2.4 LY294002对CSCs细胞周期的影响

FCM数据显示，实验组与对照组G0G1细胞比例分别为79.65±2.41，66.22±3.71，(t=5.26，P<0.01)；G2M比例分别为10.52±0.80，11.38±2.11，(t=0.65，P>0.05)；S期比例分别为9.83±1.66，22.46±1.65，(t=9.33，P<0.01)；数据显示，LY294002导致了CSCs G0G1期细胞周期阻滞，从而影响细胞的分化及增殖能力。

2.5 LY294002对CSCs中PI3K/Akt/mTOR通路基因mRNA表达的影响

qRT-PCR结果显示，实验组诱骗受体3(DcR3)(t=15.38，P<0.01)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)(t=27.61，P<0.01)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)(t=11.68，P<0.01)及细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)(t=11.96，P<0.01)相对表达明显下降。提示LY294002可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路调控CSCs恶性行为。

2.6 LY294002对CSCs中PI3K/Akt/mTOR通路基因蛋白质表达的影响

为了进一步验证及明确LY294002通过PI3K/Akt/mTOR通路调控CSCs的具体机制，通过FCM检测该通路基因蛋白质表达及磷酸化Akt(p-Akt)表达变化。数据显示，实验组中DcR3(t=11.53，P<0.01)、Bcl-2(t=13.54，P<0.01)、mTOR(t=10.66，P<0.01)及Cyclin D1(t=9.21，P<0.01)蛋白表达量明显下降。Akt磷酸化蛋白表达下降(t=7.10，P<0.01)，提示LY294002可能通过抑制磷酸化Akt进而抑制PI3K/Akt/mTOR通路，削弱CSCs的恶性行为。

3 讨论

CSCs是存在于肿瘤中极小群(甚至无法检测)具有强大自我更新及成瘤能力的细胞，CSCs具有干细胞特征，对传统放化疗不敏感，最终介导了肿瘤的耐药、转移复发[11]。探索CSCs维持自我更新、增殖能力的内在机制以靶向杀伤CSCs，已经成为肿瘤研究的难点和热点[12]。但CSCs比例极少，获取足够的细胞并保证细胞模型的正确性就显得尤为重要。目前获取CSCs的方法主要包括：无血清悬浮培养法，免疫磁珠分选法(MACS)及流式细胞术分选(FACS)法，前两种方法操作简单、成本低，但获得CSCs纯度较低。FACS获得的细胞纯度高可以作为CSCs理想的研究模型，但其技术难度高、操作复杂，应用并不广泛[13-14]。本课题组结合前期研究基础，FACS获得CD133+CD44+及CD133-CD44-细胞群，并通过成球实验检测其自我更新能力，证明CD133+CD44+具有CSCs特征，而CD133-CD44-细胞不具有。Zhou等[6]研究也证明HCT116细胞中的CD133+CD44+细胞具有强大的自我更新、增殖及侵袭转移能力，具有CSCs特征。以上数据显示CD133+CD44+细胞可以作为CRC-CSCs研究理想的细胞模型，并用于本研究，并进一步研究PI3K/Akt/mTOR通路在维持CSCs恶性行为中的作用。

PI3K/Akt/mTOR通路被报道在包括CRC在内的多种肿瘤中异常激活，参与肿瘤血管生成、增殖、抗凋亡及侵袭转移过程，此通路的激活与肿瘤低分化、高浸润度及淋巴转移正相关[15]。PI3K磷酸化PIP2形成PIP3，继而磷酸化激活下游Akt等促进细胞恶性行为。激活的Akt能够上调Cyclin D1、c-myc等促进增殖；同时激活的Akt上调mTOR促进细胞生长；上调VEGF促进血管生成；另外，激活的Akt通过激活Bcl-2发挥抗凋亡效应[16]。目前PI3K/Akt/mTOR通路在普通肿瘤细胞或肿瘤群体细胞中研究较多，但在决定肿瘤进展的关键—CSCs中研究未见报道。本课题组前期研究已经证实CSCs与非CSCs在基因表达及功能、生物学行为方面存在巨大差异，CSCs数量极少甚至无法检测，基因在CSCs中的功能可能会被大量的非CSCs所掩盖和干扰，治疗策略无法靶向杀灭CSCs，最终导致CSCs存活及由此介导的肿瘤耐药、转移复发[7]。所以，研究并靶向作用CSCs维持恶性行为的分子机制可能是肿瘤治疗的关键[12]。因此本课题在前期研究基础上，在纯化的CRC-SCs中研究此通路对肿瘤恶性行为的影响及机制。

LY294002是强力的PI3K/Akt/mTOR通路抑制剂，通过非特异性阻断通路导致Akt磷酸化水平下降，进一步抑制下游基因Cyclin D1、mTOR、Bcl-2、DcR3、VEGF等表达，导致细胞凋亡增加、增殖及侵袭迁移能力下降[17]。本研究发现，LY294002作用CSCs后，PI3K/Akt/mTOR通路被抑制，Akt磷酸化水平降低并导致下游靶基因的mRNA和蛋白质表达下降，CSCs的自我更新能力、增殖能力明显削弱，出现G0G1期周期阻滞。传统的蛋白质检测多采用Western-blot技术，但是其检测周期长、所需样本量较大、对磷酸化蛋白检测准确性不高，用于检测极少量的CSCs中蛋白质的表达非常困难。本研究采用FCM检测蛋白质，具有操作时间短、所需样本少、对磷酸化蛋白检测更加准确的优势，非常有利于检测CSCs中磷酸化蛋白的表达[9-10]。

本研究首次发现LY294002可以通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路削弱CSCs的自我更新能力，这一作用未见其他研究团队报道。自我更新是指CSCs通过对称或者不对称分裂产生新的CSCs及各种肿瘤细胞，自我更新能够维持CSCs多分化潜能，是肿瘤存活、治疗抵抗、转移复发的关键，深入研究CSCs自我更新机制，对于开发靶向杀伤CSCs的药物及治疗策略具有重要意义。但本研究提示的LY294002可以通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路调控CSCs自我更新能力的机制需要进一步研究。以上研究提示，LY294002可以阻断PI3K/Akt/mTOR通路激活进而抑制CRC-CSCs自我更新、增殖，表明阻断该通路可能有效抑制CSCs恶性行为，为靶向杀灭CSCs提供新的靶点。

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