VCA-IgA联合eIF4E检测对鼻咽癌早期诊断的意义

桑 畅

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是中国福建、广东等南方数省高发的头颈部恶性肿瘤之一，具有高复发、易转移等特点[1-2]。临床上，至少约60% NPC患者在确诊时肿瘤细胞就已经发生转移，导致了该类疾病的临床治疗效果不理想，患者预后差[3]。目前研究发现NPC的发病和病毒、遗传以及环境因素影响相关，国内外学者已证明NPC的发生与感染EB病毒密切相关[4]，鼻咽癌患者外周血中存在很多与病毒相关抗原、 抗体。 EB病毒特异性抗原包括早期抗原(early antigen，EA)、膜抗原(virus capsid antigen，VCA)、衣壳抗原(membbrance antigen，MA)以及EB病毒核抗原(EB virus nuclear antigen，EBNA)。过往检测EB病毒壳IgA抗体 (VCA-IgA)或早期抗原IgA抗体(EA-IgA)等EB病毒相关的特异性抗体等NPC的血清标志物来诊断鼻咽癌，然而其具有较高的假阳性，导致诊断的不准确性[5]。常规检测方法包括免疫荧光、免疫酶法以及ELISA法等，但以上方法操作繁琐，往往受主观因素影响，易出现假阳性等问题，不利于检测标准的建立和快速准确诊出方法的形成[6]。研究表明，真核细胞翻译起始因子 4E(eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E)在调节蛋白质翻译过程中扮演重要角色，受其调节的cyclin Dl、MMPs、VEGF及成纤维生长因子等与细胞增殖、转移或组织血管生成等相关蛋白均与肿瘤病理生理过程相关[7-8]。当细胞内eIF4E表达增加，某些和细胞增殖、血管的形成及肿瘤发生相关的关键蛋白合成显著上升，说明eIF4E高表达能够促进某些恶性肿瘤的相关基因合成，eIF4E在细胞恶性转化及肿瘤转移中发挥极其重要的作用[9]。目前临床上关于eIF4E在鼻咽癌组织中的表达及其在鼻咽癌诊断的相关性研究相对较少。eIF4E可以作为一种新型肿瘤标志物与VCA-IgA联合检测对探索新型有效的NPC早期诊断方法具有重要意义[10]。本研究采用ELISA联合q-PCR检测VCA-IgA及eIF4E在鼻咽癌早期诊断中的意义，为临床上鼻咽癌的诊断提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集我院于2012年6月至2016年6月期间收治的NPC患者60例(NPC组)，其中男性41例，女性19例，年龄43～75岁，平均(55.4±11.3)岁。同期收治的鼻腔乳头状瘤、纤维瘤、血管瘤及鼻息肉等良性肿瘤患者45例(对照组)，其中男性29例，女性16例，年龄35～67岁，平均(51.3±12.1)岁。以上患者既往无其他恶性肿瘤病史，且均由X射线、CT及病理学检查确诊，结果符合NPC及其他相关疾病诊断标准。所有患者组织样本均在病理学检查中由电子鼻咽镜获取，切取标本前均未接受放疗或化疗。

1.2 仪器与试剂

EBV抗体定量检测ELISA试剂盒购于德国IBL 公司，检测平台为美国BIO-RAD 680型全自动酶联免疫分析仪。RNA提取试剂盒及荧光定量PCR检测试剂盒(一步法)均由美国Thermo公司提供，eIF4E上下游引物由上海生物工程股份有限公司合成，检测平台为ABI 7900型高通量快速实时荧光定量PCR仪，由美国ABI公司生产。

1.3 血清VCA-IgA水平检测

2组患者清晨空腹抽取外周静脉血，离心分离血清，由我院检验科行血清VCA-IgA检测，所用方法为ELISA 定量检测法。过程简述如下：①包被：设置空白对照、阴性对照，将抗原用包被稀释液稀释至合适浓度，每孔20～200 μL，加抗原100 μL，置37 ℃，4 h后弃去孔中液体；②封闭酶标反应孔：用5%小牛血清置37 ℃封闭40 min，并除去各孔中的气泡，封闭结束洗涤3遍，每遍3 min，吸干孔内液后在吸水纸上拍干；③加入合适的浓度梯度待检测样品：采用1∶50～1∶400的稀释度进行稀释，保证样品吸取量超过20 μL，然后将稀释好的样品加入反应孔中，每孔100 μL，37 ℃，60 min后弃去孔中液体洗涤3次；④加入酶标抗体：根据说明书提供的稀释度进行稀释37 ℃，30 min，弃去孔中液体，洗涤；⑤加入底物液：选择TMB-过氧化氢尿素溶液，每孔100 μL，于37 ℃避光放置3-5分钟，加入终止液显色；⑥终止反应：每孔加50 μL终止液终止反应，于20 min内450 nm波长读取各检测孔的吸光度。应用CurveExpert V1.3分析软件绘制“浓度—吸光度”标准曲线，再经标准曲线计算各样本实际血清VCA-IgA含量。以试剂盒为参考指标，>15 U/ml记为VCA-IgA阳性。

1.4 组织eIF4E mRNA表达水平检测

各组患者组织样本匀浆后提取总RNA，利用Thermo Fermentas 反转录试剂盒的说明书操作步骤进行RNA反转录，分别将2 μg的RNA、1 μL的Oligo(dT)以及8 μL的DEPC水加PCR管中，小心吹打后用微型离心机离心、混匀，进行整个操作过程在冰上完成，然后按试剂盒说明书所列方法配制PCR反应体系，每组体系加入10 μl RNA模板，总体系为25 μl。eIF4E上下游引物分别为：5’-ACCTACAACCGATAGCTGCTG-3’和 5’-TTCCGATCTGCTTGTACTGCA-3’，产物长度208 bp。PCR反应条件为94℃预变性5 min，94 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。以GAPDH为参比基因，应用2-ΔΔCT法计算各样本组织中eIF4E mRNA的相对表达。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 2组患者VCA-IgA阳性率及eIF4E mRNA水平比较

NPC组和对照组的血清VCA-IgA阳性率分别为78.3%(47/60)和46.7%(21/45)。分析发现，与良性对照组相比，鼻咽癌组患者血清VCA-IgA水平和组织eIF4E mRNA均明显升高(P<0.01)，见表1。

表1 2组患者血清VCA-IgA水平和eIF4E mRNA表达情况

2.2 NPC患者血清VCA-IgA水平和组织eIF4E mRNA表达与临床病理参数关系

血清VCA-IgA水平与NPC患者临床分期、病理类型和淋巴结转移间无明显关联(P>0.05)。而各病理类型患者癌组织中eIF4E mRNA的表达水平间均有差异，晚期鼻咽癌患者以及发生癌细胞分化和淋巴结转移患者组织中eIF4E mRNA表达均明显升高(P<0.01)，但淋巴结近端与远端转移患者间无明显差异(P>0.05)。见表2。

表2 NPC患者血清VCA-IgA水平和组织eIF4E mRNA表达情况

2.3 2组患者血清VCA-IgA水平与组织eIF4E mRNA表达情况相关性分析

2组患者血清VCA-IgA水平与组织eIF4E mRNA的相关性分析如表3所示。结果显示，良性对照组患者2种检测指标间无明显相关性(P>0.05)，而鼻咽癌组以上指标间表现出明显的正相关(P<0.01)。

表3 各组患者2种检测指标间的相关性分析

3 讨论

在我国，NPC是常见多发肿瘤之一，其发病率位居头颈恶性肿瘤首位，主要以低分化鳞癌为主[11]。目前NPC的发病机制尚不清楚，由于其早期症状复杂，鼻咽位置隐蔽，早期临床诊出率较低，约60%患者在确诊时已经发生肿瘤细胞转移扩散，导致患者的治疗预后差，生存周期短等[12]。常规的NPC早期筛查多以免疫酶法为主，该方法由镜下观察检测，结果判定存在一定的主观性。常规病理学检查步骤较为繁琐，且耗时较长，临床上往往因确诊需要，达不到早期诊断的目的[13]。IgA在鼻咽癌中具有高度特异性，因此大多实验室利用免疫荧光技术或者酶联免疫吸附试验来检测患者血清中的IgA特异性EB抗体，而对于前期筛查鼻咽癌高危人群也采用VCA-IgA抗体检测[14]。研究发现无论是临床诊断还是普查追踪鼻咽癌患者，EB病毒的VCA-IgA抗体均是一个具有重要意义的标志物，然而临床工作中，90%左右的人VCA-IgA抗体常常处在转阴转阳的波动中，仅8.41%的患者VCA-IgA抗体保持原来抗体特征[15]。此外，eIF4E基因是一条长25 kD位于4q21-4q25可调控真核细胞蛋白质翻译过程的限速蛋白。近年研究发现eIF4E基因可在细胞分化、生长过程中发挥作用的原癌基因 。有研究发现，多种恶性肿瘤患者体内均检测到eIF4E高表达，特别是在头颈部鳞状细胞癌中更为明显； 肿瘤组织中eIF4E的高表达可促进细胞增殖、恶性及肿瘤转移；此外，eIF4E作为蛋白质翻译调节中的重要成分，主要受到cyclin Dl、MMPs等因子调节，参与细胞增殖、转移及血管生成等肿瘤病理生理过程[16]。因此，eIF4E可以与VCA-IgA联合检测作为诊断鼻咽癌标志物，这对于NPC早期诊断方法具有重要意义[17]。

本实验中检测VCA-IgA水平采用的是目前应用广泛的ELISA法，结果判读明显优于传统检测手段[18]。从检测结果可以看出，NPC组患者的血清VCA-IgA阳性率为78.3%，且整体平均水平也明显高于正常标准(15 U/ml)，表明VCA-IgA作为NPC的标志物具有显著的特异性和灵敏性。虽然良性对照组患者的血清VCA-IgA阳性率明显低于鼻咽癌组，但其阳性率和整体水平仍明显高于正常标准。由此看出目前仍存在某些NPC患者的VCA-IgA特异性低以及良性或非肿瘤性疾病可能造成VCA-IgA假阳性等问题，因此单一借助VCA-IgA等标志物的早期筛查可能存在一定的局限性。我们前期借助了qPCR方法检测了患者组织中的eIF4E mRNA的表达情况，发现鼻咽癌患者组织中eIF4E mRNA表达水平普遍较高，且整体水平明显高于对照组，由此推测NPC患者组织中eIF4E的表达具有显著性差异。我们也应用了Pearson相关性检验分析了2组间血清VCA-IgA水平和eIF4E mRNA表达的相关性，结果发现以上指标在对照组中无明显相关性，而在NPC组中表现出明显的正相关。

综上所述，VCA-IgV作为NPC的特异性标志物在良性患者中存在一定的假阳性，但结合组织eIF4E表达差异，可进一步提高NPC的诊出率，因此VCA-IgA联合eIF4E检测可能在NPC的早期诊断中具有重要应用价值，值得临床推广使用。

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