芫荽水提物的体外抗氧化活性和抑制α-葡萄糖苷酶作用的研究

徐悦，张卫明，马世宏，聂韡，单承莺*

(1.南京师范大学 生命科学学院，南京 210097；2.南京野生植物综合利用研究院，南京 210042)

芫荽(CoriandrumsativumL.)，又名香菜、胡荽等，伞形科芫荽属，是一种1年生或2年生的草本植物。芫荽原产于欧洲地区，早于汉代引入我国，目前内大部分省份地区均有种植，是人们熟知的餐桌上的调味蔬菜。芫荽中含有丰富的营养成分，具有抗氧化、降血糖、抗焦虑等药理作用，在临床上也有一定的食疗作用[1]。目前对芫荽提取物的活性研究的报道大多集中于极性溶剂提取物[2-5]，对其水提物的活性研究甚少，芫荽作为一种常见的可食用的香辛蔬菜，同时又是一种全株可入药的药用植物，关注并研究其水提物的活性同样具有广泛的应用意义。本实验主要研究了芫荽成熟茎叶和籽实两部分的水提物的抗氧化活性和抑制α-葡萄糖苷酶的作用效果，以期为更好地开发利用芫荽植株提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

成熟期芫荽茎叶和芫荽籽：均采自江苏省南京市高淳区，经南京野生植物综合利用研究院肖正春教授鉴定为伞形科芫荽属(CoriandrumsativumL.)的茎叶和籽实。

1.2 实验试剂和仪器

1.2.1 试剂

芦丁标准品：购自北京百灵威科技有限公司；DPPH：购自上海麦克林公司；α-葡萄糖苷酶、阿卡波糖：购自上海源叶科技有限公司；PNPG：购自阿拉丁试剂(上海)有限公司；其余试剂：均为国产分析纯。

1.2.2 仪器

电子分析天平 上海越平科学仪器有限公司；高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱 上海跃进医疗器械厂；T6紫外/可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；Thermo Scientific Multiskan FC 酶标仪 赛默飞世尔(上海)仪器有限公司；台式微量高速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；旋转蒸发仪 上海亚荣仪器厂；数显恒温水浴锅 常州天瑞仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理和提取物制备

将芫荽籽置于烘箱中，105 ℃烘干，粉碎后过40目筛，备用。成熟芫荽茎叶洗净，晾干，再于烘箱中105 ℃烘干，剪碎后备用。分别取适量芫荽籽和芫荽茎叶，加入蒸馏水，料液比均为1∶10，加热至微沸，水提3 h，滤去残渣，滤液减压浓缩干燥制得水提物浸膏。

1.3.2 提取物总黄酮含量的测定

标准曲线的制备，参考文献[6]的方法，以芦丁的浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，计算出回归方程。

样品测定：取适量水提物浸膏配制成1 mg/mL的水溶液，按照标准曲线制备的方法测定其吸光值，由回归方程计算该样品液中总黄酮的含量C，并由此计算出芫荽籽和成熟茎叶中的总黄酮含量。

1.3.3 体外抗氧化活性的研究

1.3.3.1 提取物对羟自由基的清除作用

采用改良的Smirnoff水杨酸法，实验以抗坏血酸(VC)做对照，计算清除率。

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100。

注：A1为加样品/VC，含H2O2；A2为加样品/VC，不加H2O2；A0为不加样品/VC，加H2O2。

1.3.3.2 提取物对DPPH自由基的清除作用

[2]，[7]方法，DPPH溶液浓度为75 μmol/L。实验以抗坏血酸(VC)做对照，计算清除率。

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100。

注：A1为加样品/VC；A2为只加入样品/Vc；A0为不加样品。

1.3.3.3 提取物还原能力测定

参考文献[8]的方法，测定两种提取物的还原力，实验以抗坏血酸(VC)为阳性对照，结果以OD值的大小来表示还原能力。

1.3.4 体外降血糖活性的研究

1.3.4.1 抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究

参考文献[9]，配制0.4 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液、0.01 mol/L PNPG溶液和0.1 mol/L碳酸钠溶液，备用。在96孔板中依次加入20 μL样品溶液和40 μL α-葡萄糖苷酶溶液，于37 ℃恒温箱中放置10 min，然后加入30 μL PNPG底物溶液，37 ℃温度下反应20 min后，加入100 μL Na2CO3溶液终止反应，用酶标仪在405 nm波长下测定吸光值。实验以阿卡波糖为阳性对照，步骤同上，计算抑制率。

抑制率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100。

注：A1为加样品；A2为加样品，不加酶和底物；A0为不加样品。

1.3.4.2 抑制α-葡萄糖苷酶动力学研究

根据文献[10]，设置一系列底物浓度1.25，2.5，5，10 mmol/L。加入同一浓度抑制剂，在不同底物浓度条件下测定葡萄糖苷酶的活力，然后改变抑制剂的浓度，得到一系列不同底物浓度条件下的酶活力，实验方法同1.3.4.1。根据Lineweaver-Burk双倒数作图法结果的特征分析，推断提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制类型。

2 结果与分析

2.1 提取物总黄酮含量

根据实验方法1.3.2进行测定，绘制标准曲线，见图1。

图1 芦丁标准曲线

芦丁浓度C和吸光值A的关系曲线的回归方程为：A=7.9271C-0.0016，相关系数R2=0.9998。根据实验结果和回归方程可计算出：芫荽籽水提物芫荽籽中总黄酮含量为4.4 mg/g，成熟芫荽茎叶中总黄酮含量为27.4 mg/g。

2.2 体外抗氧化活性的研究

2.2.1 提取物对羟自由基的清除作用

羟自由基(·OH)是造成组织细胞损伤的重要活性氧之一。通过测定对羟自由基清除的作用可以体现出抗氧化活性能力。

图2 两种水提物对羟自由基的清除作用

由图2可知，芫荽籽水提物和成熟芫荽茎叶水提物对羟自由基均有较好的清除作用，在2～10 mg/mL浓度范围内清除自由基的能力随着提取物的浓度增加而逐渐提高，10 mg/mL后略有下降。芫荽籽水提物和成熟芫荽茎叶水提物均在浓度为10 mg/mL时对羟自由基有最大清除率，分别为61.89%和32.42%，分别相当于0.13 mg/mL和0.07 mg/mL VC溶液的清除率，在实验浓度范围内，籽水提物对羟自由基的清除率明显高于茎叶提取物(p<0.05)，但两者均低于VC的清除能力。

2.2.2 提取物对DPPH自由基的清除作用

DPPH自由基清除实验广泛应用于评价植物提取物的抗氧化能力。

图3 两种水提物对DPPH自由基的清除作用

由图3可知，两种提取物对DPPH自由基的清除能力均呈现出浓度依赖性，且茎叶提取物对DPPH的清除率高于籽提取物，两种水提物对自由基的清除作用具有显著差异(p<0.05)，其中芫荽籽提取液的EC50为2.75 mg/mL，茎叶提取液的EC50为1.83 mg/mL，均显示出良好的清除作用，但均低于阳性对照VC(EC50=0.044 mg/mL)。

2.2.3 提取物还原能力测定

还原能力的测定是以普鲁士蓝[Fe4( Fe(CN)6)3]生成量作为指标，由波长700 nm处吸光值变化反映还原力大小，吸光值愈高表示样品的还原力愈强。

图4 两种水提物的还原能力

由图4可知，与未添加抗氧化剂组相比，添加了提取物的实验组的吸光值均明显升高(p<0.05)。在实验浓度范围内还原力大小均与两种提取物的浓度呈现出浓度依赖性，且芫荽茎叶提取物的还原能力明显高于籽提取物(p<0.05)，实验最大浓度1.2 mg/mL的芫荽籽水提物和茎叶提取物的还原能力分别相当于38，49 μg/mL的VC溶液的还原力。

2.3 体外降血糖活性的研究

2.3.1 抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究

α-葡萄糖苷酶是一种糖苷水解酶，具有抑制作用靶点，可被作用于调节体内糖代谢水平，目前，例如阿卡波糖等α-葡萄糖苷酶抑制剂已经成为一种成熟的治疗糖尿病的药物。

图5 两种水提物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

由图5可知，芫荽籽水提物和芫荽茎叶水提物均对α-葡萄糖苷酶有抑制作用，在实验浓度范围内，抑制效果均会随着浓度增高而增强，两种提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用效果具有显著差异(p<0.05)，成熟芫荽茎叶提取物的抑制效果优于芫荽籽提取物的作用效果，两者的EC50分别为4.6，6.8 mg/mL。阳性药物阿卡波糖的EC50为28.1 mg/mL，由此可见，芫荽提取物明显表现出更高的抑制效果，具有作为潜在的α-葡萄糖苷酶抑制剂的开发前景。

2.3.2 抑制α-葡萄糖苷酶动力学研究

图6 成熟芫荽茎叶水提物对α-葡萄糖苷酶作用的双倒数动力学曲线

图7 芫荽籽水提物对α-葡萄糖苷酶作用的双倒数动力学曲线

由图6和图7可知，在两种不同提取物抑制反应实验中，加入不同浓度抑制剂后，三条作用曲线相交于x轴，即酶的米氏常数Km保持不变，由此可以推断出，芫荽籽水提物和成熟芫荽茎叶水提物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型均属于非竞争性抑制。

3 讨论

芫荽作为一种药食两用的香辛植物，一直受到国内外科研人员的广泛关注。已有文献中对芫荽极性溶剂提取物研究的报道居多，例如陈志红等用乙醇作为提取剂测定了新鲜芫荽植株总黄酮含量(8.493 mg/g)、清除羟自由基(IC50=122.331 mg/L)和O2-(IC50=71.535 mg/L)的能力；韩潆仪等[11]研究发现芫荽乙醇提取物具有对DNA和蛋白质两种大分子氧化损伤的保护活性，最小保护质量浓度分别是4.0，125.0 μg/mL；李锋等[12]比较了芫荽籽不同溶剂粗提物的体外抗氧化活性，发现95%乙醇提取物具有较好的清除H2O2和羟自由基的能力；Mojtaba等[13]评价了芫荽的体内抗氧化活性，发现乙醇提取物对大鼠神经元损伤具有保护作用。然而芫荽作为常见的蔬菜，有关其水相提取物的研究报道略少，因而本实验主要研究了芫荽水提物的生物活性，包括清除自由基能力和抑制α-葡萄糖苷酶的活性。由实验结果可知，成熟芫荽茎叶和芫荽籽中的总黄酮含量分别为27.4，4.4 mg/g，且两种水提物在不同抗氧化体系中均具有良好的效果，虽然与极性溶剂提取物相比抗氧化能力较弱，但水提物制备方便、安全可食，依旧具有潜在的开发为天然抗氧化剂的价值。

芫荽中不仅含有黄酮类化合物，据报道还含有多种酚酸成分[14]，多酚类化合物不仅具有良好的抗氧化效果，同时也具有降血糖的效果[15]。目前有关芫荽降血糖的报道以外文文献较多[16,17]，国内有关报道甚少。经本实验研究发现，芫荽籽水提物(EC50=4.6 mg/mL)和成熟茎叶水提物(EC50=6.8 mg/mL)在较低浓度条件下对α-葡萄糖苷酶就能表现出较好的抑制效果，比阳性对照阿卡波糖作用效果更好，表现为非竞争性抑制。目前上市应用的α-葡萄糖苷酶抑制剂有三类：阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇，虽然这类抑制剂具有突出的降血糖效果，但是通常也会伴随一定的胃肠道方面的副作用[18]，而天然α-葡萄糖苷酶抑制剂具有更安全、易获取的优势，因而越来越多的研究人员尝试从天然植物中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂。例如，张钟等[19]从荔枝中分离出多糖成分，发现在80 mg/mL条件下具有最佳抑制效果。高小平等[20]从24种中药材中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂，发现大黄、山茱萸、赤芍、五倍子这4种提取物具有良好的抑制效果。本实验为进一步更全面地研究芫荽提供了基础，其水提物在天然抗氧化剂和天然α-葡萄糖苷酶抑制剂方面具有潜在的开发应用前景。

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