基于变应原的过敏性疾病分子诊断研究进展

卢兵 万君， 姜文锋 崔洁

三峡大学第三临床医学院，葛洲坝集团中心医院1变态反应性疾病研究所，2药学部（湖北宜昌 443002）

过敏性疾病（allergic disease）又称变态反应性疾病，主要包括过敏性鼻炎、过敏性哮喘、食物过敏、特应性皮炎以及严重过敏反应等。过敏性疾病严重影响了患者的生存质量，导致医疗费用增高，社会经济影响增大，目前已成为全球范围内重大的公共卫生问题。近年来随着人类生存环境和生活方式的改变，过敏性疾病的患病率也急剧上升，影响着全球约30%的人口［1］。

血清免疫球蛋白E（serum immunoglobulin E，IgE）在过敏性疾病的发病机制中起着重要的作用，IgE含量通常与特异性变应原相关［2］。在大多数情况下，IgE介导的免疫机制是唯一导致一型变态反应的机制。因此，过敏性疾病诊断的第一步是识别引起变应原（allergen）产生的特异性IgE，并确定其是否与当前疾病存在关联。

20世纪60年代后期所发现的IgE作为一种新的指标被引入到过敏性疾病的诊断中。此后，对不同变应原的特异性IgE的测定便开展起来［3］。早期阶段，放射免疫测定技术是测量IgE的首选，后来逐渐被ELISA技术所替代。近年来，微阵列技术已被引入作为多重组体或纯化的天然变应原组分的特异性IgE抗体（Ab）的测量手段。该技术可以用少量的血清样品检测大量的变应原。在开发测量特异性IgE新方法的同时，变应原提取物领域也发生了新的变革。起初，粗制的天然产物和非标准化提取物被作为测量工具，但随着时间的推移，过敏成分含量更高的标准化提取物提高了这些测定结果的精确性。此外，从天然来源获得的纯化蛋白质的使用也产生了飞跃式的发展。重组变应原领域的进展使得过敏反应诊断、成分分辨诊断和分子诊断（MD）的概念也有了新的发展，潜在的疾病诱发分子也得以识别［4］。同时，在天然提取物的混合物中使用重组变应原，也提高了测试的灵敏度。

本文主要就已建立的特异性IgE检测工具、变应原的提取、特异性IgE检测系统等方面展开综述。为新的变态反应性疾病诊断方法提供一定的理论基础。

1 皮肤测试和IgE单一检测系统

触发致敏源的识别是过敏诊断的基础。关于生物体及其组织释放过敏性化合物的研究从100多年以前一直持续至今。Allergome公司目前罗列出了Web平台上国际科学文献中约1 739个释放变应原分子的生物体和组织［5］。最初的皮肤试验是从变应原生物体或从其一种或多种组织获得变应原提取物，用于患者并刺激其产生过敏反应作为真正的激发试验（如食物激发或鼻/支气管黏膜暴露）。这样的测试尽管操作简单，但由于受试剂材料及提取物的影响很难按照实验室的标准测试使其规范化。

第二代体外检测方法发布后，以IgE为基础的实验室检测系统在过敏检测的质量方面已经取得了较好的结果［6］。测试所需时间在数小时数范围内，通过自动化大大降低了人力物力和实验成本，提高了过敏测试的整体质量。该方法在包括儿童过敏性鼻炎患者的监测中发挥了重要作用［7］。多次对比研究结果显示：皮肤试验和体外特异性IgE检测实验几乎可以得到相同的实验结果，两种方法各有利弊。尽管如此，皮肤试验仍然是过敏性疾病诊断的首选方法，因为与任何应用于体外系统的相同数量的试验相比，皮肤试验所用的成本要低得多。通过标准的食物变应原或吸入性变应原对过敏患者进行全面筛查时并非使用常规方法，体外系统的使用便受到一定限制［8］。

2 变应原提取物的发展

变应原提取物是不可预测的变应原性和非变应原性蛋白质的混合物。科学文献中关于变应原的起始物或终产物的标准化的论文很少，改善变应原提取物标准化的需求使得分子材料逐渐被使用［9］。除非这种方法在提高提取物质量方面有较大的进步，否则提取物本身并不能导致患者特异性IgE致敏分子识别模式的改善［10］。

20世纪80年代，先进的生物化学和分子生物学技术的出现导致变应原的表征和我们对变应原分子的认识急速提高。越来越多的报道使我们对变应原分子结构和过敏性疾病之间的联系有了更深刻的认识［11］。为了证明其在选定患者中的生物活性，许多变应原分子已被用于皮肤测试，并显示出基于分子水平的皮肤试验用于过敏诊断的可行性。尽管如此，致敏分子尚未进入过敏性疾病的常规诊断，主要是由于在体内应用的制剂极少（皮肤试验中使用的分子浓度在10～100 μg/mL之间），应用前需要进行大量的准备工作，因此成本高。此外，天然或重组的致敏分子需要被批准为药物后才能在体内使用，这也是限制因素之一。

总之，建立体外系统中过敏性分子诊断的临床意义越来越明显。目前，可用于单重IgE检测系统的天然和重组变应原分子日益全面，其使用的主要限制因素是成本比例的增加［12］。

3 单一化合物与复合物的特异性IgE检测系统

单一和多重测试分别指用于检测特定分析物（即特定IgE）的单一试剂的选择应用以及多重试剂在同一运行中同时使用并按预定的试剂组进行的测试。因此，两种测试方法之间的差异是通过应用单个样本（即人血清、血浆或任何其他体液）获得的结果的数量。皮肤测试可以被认为是一个多重测试系统，但是应用变应原提取物的数量变化很大，使得皮肤测试方法仅仅只能成为单独的诊断测试。多重测试系统被设定为使用完全相同数量的变应原制剂，有一些体外系统则可以检测一组固定的变应原提取物［13］。为了全面分析，多重测试系统需要多个样板和一定量的毫升量级的样本量，并产生多个结果。

20多年前，基因组学研究将“微观”维度引入生物医学，形成了微阵列技术，以平行检测细胞转录物的表达模式。DNA微阵列被证明是非常有用的工具，可以同时探索数以千计的基因表达差异。蛋白质组学微阵列技术紧随其后，用于过敏性疾病诊断，被称为ISAC系统。还有其他用于检测微量IgE的体外检测装置，其中大多数使用的是变应原提取物或其他实验化合物。这些微阵列技术通常用于实验，而非常规的疾病诊断。IgE检测的微阵列技术被归类为多重体外诊断（multiple in vitro diagnosis，IVD），变应原分子和微阵列技术的结合被称为IgE生物芯片（biochip）技术，这些新技术为诊断IgE介导的过敏性疾病奠定了新的基础。

4 IgE生物芯片：过敏诊断新技术

作为IgE IVD的新工具，IgE生物芯片显示了克服“经典”过敏诊断工具报道的局限性，为潜在的IgE介导的过敏性疾病患者的诊断引入了新的概念。基于前期的工作，结合在过去几年中常规使用的变应原组分微阵列技（immunosolid phase allergen chip，ISAC）的文献报道，IgE IVD领域也在不断完善和发展。ISAC IgE生物芯片目前拥有来自43种不同生物的103个分子和25个变应原组标记物，包括食物、吸入剂、真菌、乳胶和毒液过敏原等［14］。所有的变应原在生物芯片上都一式三份地点出来，从而提供了IgE IVD的自身对照。与传统的IVD相比，这种方法更加精确，然而不使用新的试剂，则不能重复测试，从而导致增加成本。

与单一测试系统相比，使用来自IgE生物芯片上给定的全面的变应原分子组可以获得基于提取物的较为全面的诊断［15］。但变应原提取物通常质量较低，由于失去了变应原分子，其变应原含量不同，不能被新鲜来源取代，这种现象可能导致假阴性结果，使患者存在过敏反应的风险。

在IgE生物芯片上可以发现的变应原分子的数量几乎不受物理或技术限制［16］，新的变应原分子可以不断被添加到当前的生物芯片上，使得所有变应原结构，无论其IgE反应的患病率的高低，都能在生物芯片上发现。应用这一策略，在ISAC IgE生物芯片中可添加许多新的变应原。

点样所需的变应原浓度约0.1～1 ng，一些尚未被克隆的变应原分子也可用于点样。因此，过敏源材料中若含有高度纯化的天然变应原，即使含量非常低也可以与重组体一道被检测出来。许多公司和实验室均在研究用于生物芯片的变应原材料。

目前基于变应原的生物芯片对IgE检测的敏感性和特异性尚未通过分子水平的全面评估。如果使用重组分子，则应该知道其同种类型的亚型，以便对该变应原分子进行全面而正确的评价。生物芯片上可用的同源分子组对于增加系统的灵敏度和研究单个患者的IgE特征尤为重要。

一组同源分子的数量有多种，尽管不能被IgE共同识别，但可以从同型分子预测其他分子结构。同源分子的IgE也可能受到不同环境暴露所确定的敏化剂性质的影响，但使用同源变应原会增加我们对IgE表位识别的了解，从而更好地理解变应原结构，找到符合预期的临床表型。

SCALA等［17］报道了基于IgE生物芯片的流行病学研究。在一次大规模的基于ISAC生物芯片常规应用的调查中发现，这种应用可以在世界范围内产生一个共同的、标准的工具，而不局限于地理区域中变应原提取物的差异。同源分子的IgE免疫关系将变应原物种分布在不同的地理区域，说明这些地区的症状可能是由同源变应原触发的，使得变态反应科医师对该地区的过敏性疾病患者引起警惕。医生可以通过应用所有可用的分子表型（包括IgE阴性结果和已确定的阳性结果）来获得过敏患者的分子图谱，目前已有许多关于过敏性分子用于描述过敏性患者临床表型和预后的报道［18］。

无论接触的途径和地点，即使在患者不能准确描述其症状的情况下，任何性质的变应原分子的鉴别都有助于患者和过敏医生获得致敏的完整和全面的临床视图，从而大大缩短了收集完整病史的时间。基于生物芯片的IVD需要的血清量仅20 μL，所以患者在接受诊断时不受年龄差异的影响。只有当生物芯片上的致敏分子加倍时，血清量才会增加。同样对于单一过敏性IVD，当要测试的变应原的数量增加时，需要血清体积成正比的增加。

尽管通过IgE生物芯片方法检测过敏诊断的成本的研究较少，但检测是由单个生物芯片所需的极低量的变应原分子制剂确定的，假设从小规模生产转向大规模生产，生物芯片成本将会稳定下降。此外，基于生物芯片的过敏测试与皮肤测试相比灵敏度更高，也减少了在达到最终诊断之前所需的步骤，使得过敏诊断的间接成本显著降低。

基于生物芯片的过敏诊断存在诸多优点，但也存在一定的弊端。包括系统成本高、自动化缺乏、检测到大量没有实际症状的致敏的风险以及当前生物芯片信息不全等。但IgE的产生是临床过敏反应发生的第一步，基于生物芯片的IVD可以极大地帮助患者发现早期过敏反应的持续过程，从而在最早阶段诊断出过敏性疾病。此外，一些患者过敏后有时可能无症状出现，且过敏反应的症状可能随着时间的变化而改变，分子变态反应专家应该跟进这些无症状或轻度症状的患者，并提出适当的治疗方法。基于生物芯片的IVD分子诊断中，识别、鉴定和发现新的化合物是一个持续的过程。尽管许多基本的变应原化合物已经被发现并被充分描述，但新的化合物数量还在增加。包括EuroPrevall在内的一些项目正在进行系统的变应原研究［19］，如果生物芯片生产商能够提供所有的变应原信息，这些资源将得到共享。

5 小结与展望

变应原分子水平诊断时代的到来将大大改善IVD的应用方法。微型技术已经从基础的变应原研究演变而来，转化为过敏性疾病的有意义的分子标记。此外，生物芯片IVD可以在同一运行中通过实现IgE检测来进行IgG亚类的预测，也可以使用同源化合物建立第二个水平的过敏诊断。过敏性疾病诊断工作可以从目前的辅以IgE单重检测的皮肤点刺试验改变为多重生物芯片试验。

目前，基于生物芯片的IVD分子诊断中还有许多需要改进的地方，分子变态反应学家在未来还需要做大量的工作来为这些新的过敏性疾病诊断提供更强的临床基础。当前面临最大的挑战是开发生物信息学工具来帮助分子变态反应专家管理、理解和运用这种高通量的IgE检测系统。

总之，变应原种类和组分的多样化要求需要我们继续对更多的变应原及其组分进行生物学及过敏性疾病临床症状之间的关系研究。未来，将会有更多的变应原特异性诊断方面的研究，以识别患者真正的致敏组分和交叉反应组分，帮助医生对患者进行正确的过敏风险评估及指导患者选择合适的变应原规避措施和治疗方案。