肝细胞癌病因及发病机制的研究进展

王若帆，孙立众，张立鑫，杨发才，谢梦忆，李敬东

(1川北医学院附属医院，四川南充637000；2川北医学院；3川北医学院肝胆胰肠疾病研究所)

原发性肝癌(PLC)是以肝脏为原发灶的恶性肿瘤，它包括多种亚型，其中，成人以肝细胞癌(HCC)和胆管癌最为常见，儿童则以肝母细胞瘤多见[1]。HCC是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，也是全球第二大因癌症导致死亡的原因。Bertuccio等[2]通过对世界范围内多个国家世卫组织1990～2014年死于HCC患者的数据库进行分析发现，许多国家HCC病死率近年有所上升，因此，研究HCC相关的发生发展机制将为该肿瘤的治疗及预后提供临床参考。在我国，HCC的病因以乙型肝炎病毒引起的慢性肝损伤为主，其他因素如丙型肝炎病毒感染、乙醇滥用、含黄曲霉毒素食物摄入、非乙醇性脂肪肝损伤[3]。当前HCC的治疗手段主要有肝切除术、肝移植术、介入治疗、生物治疗、中医中药治疗、放疗、化疗等[4]。早期发现早期治疗HCC最为有效[5]。近年来对肝癌分子水平上的相关研究越来越多，多项研究从多个角度证明肝癌的发生是个十分复杂的过程，目前来说肝癌的发病机制还未完全解密。本文将着重从HCC的发病原因及机制两个方面对其基础研究的主要进展作一综述。

1 病因

1.1 肝炎病毒感染 乙肝病毒是全球范围内导致HCC的最常见原因，该病毒经由母婴途径、性途径、带病蚊虫叮咬等方式传播。患者多为出生时即感染该病毒，其中超过90%转变为慢性感染；仅有5%～10%的乙肝患者是在成年后获得感染而成为携带者的，而在这其中30%以上的人会发展成为慢性肝病，并依次经由肝炎、肝纤维化、肝硬化、最后发展成为肝癌[6]。有研究表明感染乙肝病毒伴丙肝病毒或者丁肝病毒的人，HCC风险性会增加。高乙型肝炎病毒抗原(HBeAg)和高乙型肝炎病毒(HBV)-DNA水平表明HBV复制水平较高，此时HCC风险性亦会增加。另外，一项来自亚洲的研究提出，感染乙肝病毒C基因型的人与B基因型相比有更严重的肝脏疾病[7]。目前，早期接种乙肝疫苗已成为预防乙肝病毒感染最有效的措施，同时也是预防HCC、降低成人死亡率最简单有效的方法。通过抗病毒治疗病毒性肝炎患者、安全的输血及注射同样也可预防HCC的发生[8]。

1.2 过度饮酒 乙醇代谢使得肝细胞产生活性氧(ROS)，氧化应激增加。成人适度饮酒可能对健康有一定益处，如降低冠心病、Ⅱ型糖尿病的发病风险。长期饮酒导致肝脏疾病，其疾病进展速度及严重程度根据饮酒量的相对水平不同在个体之间可出现明显的差异，这种变异可归因于乙醇代谢酶(醇脱氢酶、醛脱氢酶)的活性以及在不同个体的表达量有差异，除此之外也受乙醇摄入方式、个体营养状况、性别、吸烟或滥用其他药物与否、肥胖、HBV或丙型肝炎病毒(HCV)感染等的影响[9]。Wang等[10]的研究表明在对于非酒精性脂肪肝炎病人即使适度饮酒也会加重肝脏炎症及细胞凋亡；而对于大多数长期过度饮酒的人，其肝脏会经历脂肪变性、脂肪性肝炎、肝纤维化，但只有10%的人会发展成为肝硬化，而在肝硬化病人中只有1%～2%的人才会最终进展为HCC[11]。不可忽视过度饮酒这一病因导致的肝癌所带来的沉重社会负担，严格控制饮酒量以及提高居民对乙醇和HCC联系的意识可能对于预防居民过度饮酒引起的HCC具有一定意义。

1.3 黄曲霉毒素中毒 黄曲霉毒素是有黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物，易污染水稻、玉米、牛奶等食物。它分为多种类型，其中以黄曲霉毒素B1(AFB1)最为常见，它可能导致多种癌症，如肺癌、乳腺癌、肝癌、结直肠癌等，其中AFB1导致HCC是毋庸置疑的，其毒性和致癌性也最强。食用被AFB1所污染的食物可以降低细胞介导的免疫，同时诱导炎症反应导致肝实质细胞坏死、肝内胆管损伤、肝脏出血。慢性HBV携带者暴露在AFB1中可能以剂量反应方式增加其患肝硬化和HCC的风险[12]。另外，最近有动物研究揭示了妊娠可能是母体健康的一个关键的敏感性窗口，此时改变了AFB1的代谢并增加小鼠肝脏的DNA损伤，使之可能更易患HCC[13]。AFB1参与肝癌的发病主要是通过影响细胞色素P450的多态变异体中的CYP3A4酶，从而产生具有基因毒性的2，3-环氧化物代谢产物[14]。另外Qin等[15]利用AFB1诱导大鼠产生HCC模型，检测到HCC ROS水平明显上升，抗氧化酶活性降低。同时，促炎细胞因子、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素(IL)-1α等表达水平显著升高，所以HCC的进展可能与炎症反应密切相关。

1.4 非酒精性脂肪肝病(NAFLD) NAFLD是指除外乙醇、甲亢、药物等因素引起肝细胞内脂肪过度沉积所致的代谢综合征，其危险因素主要有中心性肥胖、2型糖尿病、血脂异常、胰岛素抵抗、香烟等，研究表明NAFLD是患HCC的一易感因素[16]，其机制在于：衰老相关分泌表型(SASP)与肥胖相关HCC的发展有着至关重要的作用。饮食或遗传性肥胖改变肠道菌群，肠道细菌可以将胆酸代谢成为脱氧胆酸(DCA)，DCA使肝星状细胞(HSC)产生SASP，导致HSC分泌各种炎症和肿瘤促进因子从而造成细胞DNA损伤，进而可引发肝细胞癌变。阻断肥胖小鼠肠道脱氧胆酸的合成或减少肠道细菌的数量可有效抑制HCC的发生[3]；另外，Ma等[17]发现了免疫反应在NAFLD导致的HCC中所扮演的重要角色，他们通过老鼠建模以及收集人类标本来进行相关检测，实验结果显示NAFLD脂代谢失代偿会选择性导致肝内CD4+淋巴细胞减少(而非CD8+淋巴细胞)，从而加速肝细胞癌变。另外CD4+淋巴细胞比CD8+淋巴细胞拥有更大的线粒体质量以及更高的ROS水平；通过长期积累在肝细胞中的亚油酸破坏线粒体功能导致比游离脂肪酸更多的氧化伤害。阻断ROS可以逆转CD4+淋巴细胞减少，延迟NAFLD对HCC的促进作用。这一研究为今后治疗NAFLD所致的HCC提供了新治疗思路。

2 发病机制

癌基因广泛存在于生物体中，通常情况下癌基因不表达，在一定诱因下，癌基因会发生活化、掌控细胞。Bishop等在20世纪70年代后期首次发现了c-myc基因后，越来越多的癌症相关基因被发现。现代观点认为，癌症是一种涉及基因组动态变化的疾病，包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活，如ras原癌基因的激活和p53抑癌基因的失活[18]。作为人体最易突变癌基因之一的ras基因，广泛参与15%～20%的人类肿瘤发生发展过程。研究表明，活化的ras蛋白会激活ras相关下游信号通路[19]，此时细胞增殖失去控制，不断地进行分裂繁殖，于是就发生了肿瘤。此外，影响肿瘤发病的另一机制自噬，它是抑制肿瘤发生的关键过程之一，通过协调炎症和免疫来抑制癌症的发展[20]。近年来对肝癌分子水平上的相关研究越来越多，多项研究从多个角度证明肝癌的发生是个十分复杂的过程，目前来说肝癌的发病机制还未完全解密。下面从肝癌相关基因、单核苷酸多态性、全基因组分析、MicroRNAs(miRNAs)四个方面分别介绍近年来广大科研人员对肝癌机制的研究所取得的进展。

2.1 HCC的相关基因

2.1.1 TP53与HCC TP53属于最早发现的肿瘤抑制基因，在与肝癌发生相关的体细胞突变谱中，TP53和CTNNB1的突变在亚洲国家、西方国家最为常见。研究表明此两种基因是以共同排斥的方式发生突变。但最近Friemel等[21]首次对这一观点提出了挑战，在HCV感染相关肝癌中出现了TP53和CTNNB1的双突变，这一结果目前还未得到广泛认可。Guichard等[22]通过对125例HCC进行高分辨率拷贝数分析以及对其中24例全外显子组序列测序，发现新的频繁突变基因IRF2，相关功能分析显示IRF2具有肿瘤抑制物特性，其灭活仅在HBV相关肿瘤中，导致TP53功能受损。对于TP53缺陷型的HCC，He等[23]构建了能够编码反式剪切分子的质粒(该质粒可以靶向作用于TP53基因的内含子6)，之后将此质粒转染到携带存在TP53突变的HCC细胞中，发现其可以减少突变TP53基因的转录并且可以产生功能性wt-p53蛋白，这使得HCC细胞的表型发生了校正。同时，在由Tp53突变的HCC细胞建立的肿瘤异种移植物中，编码TP53-PTM的腺病毒诱导细胞周期停滞和凋亡，然后阻断了小鼠肿瘤的生长。该实验首次论证了反式剪切在校正TP53缺陷型HCC细胞和异种移植物功能的作用，提供了用反式剪切修复TP53缺陷型癌症的可行性。

2.1.2 PTEN与HCC PTEN是继TP53后癌症中第二位最频繁突变的肿瘤抑制基因[24]，目前已被证实与HCC在内的多种癌症相关，它的缺失会激活PI3K/AKT信号通路，导致人类多种癌症的进展。PTEN长蛋白是PTEN的一个翻译亚型，以非自主的方式在细胞内起作用，最近有研究表明PTEN长蛋白主要与HCV病毒核心蛋白相互作用，以剂量依赖方式抑制HCV病毒的复制[25]；HBV病毒X蛋白被认为主要在转录水平上调控病毒的复制[26]，它抑制了p53介导的PTEN的转录。以上病毒可能改变了PTEN的调节能力和促凋亡能力，从而加快肿瘤形成的进程[24]。这为开发更多抗肝炎病毒药品提供机会，从而可能在一定程度上减少肝炎病毒相关PLC的发生。Shp2/Ptpn11是造血细胞中的原癌基因，它可以拮抗肿瘤抑制因子PTEN在白血病发生中的作用。Luo等[27]的研究向我们展示了Shp2和Pten在抑制PLC发生中的协同作用：他们同时敲除了肝细胞中的Shp2和PTEN基因，成功诱发早发性NASH并促进了肝肿瘤起始细胞的发生，这可能是cJun表达/激活增强以及肝微环境中ROS及炎症水平升高所致。抑制cJun通路部分抑制NASH驱动的肝脏肿瘤发生但不改善NASH。他们也在预后不良的PLC患者中检测到SHP2和PTEN的缺陷。这些数据描绘了PLC发生的机制并提出了潜在的治疗策略。

2.1.3 p16与HCC p16基因位于染色体9p21上，是一种周期蛋白依赖性激酶抑制剂，它是由3个外显子和2个内含子组成的细胞周期调控因子家族的一员，在细胞周期调控中起关键作用。最近频繁报道在HCC中，p16启动子的甲基化使得p16表达量发生了下调，这可能是由于DNA甲基转移酶(DNMT)DNMT1和DNMT3A在p16启动子的甲基化中扮演了重要角色[28]。Lv等[29]的系统评价及荟萃分析也显示肝癌与慢性肝炎及肝硬化相比p16启动子有着更高的甲基化水平、年龄>50岁的病人比<50岁的病人高、携带HBV或HCV的HCC比未携带肝炎病毒的HCC高，而与性别、肝硬化、肿瘤分化、HCC的临床分期无关。当然也有研究表明在HBV相关HCC中，乙肝病毒X蛋白(HBX)诱导p16启动子区域的组蛋白H3赖氨酸9三甲基化(H3K9me3)且抑制特异性作用于H3K9me3的去甲基化酶JMJd2B，从而提高H3K9me3的水平。即HBX通过JMJd2B通路抑制p16基因的转录，达到使肿瘤抑制基因p16沉默的目的[30]。该研究为HBX诱导的p16基因转录沉默的机制提供了新的见解，JMJd2B可能是表观遗传治疗HCC的潜在靶点。

2.1.4 nm23与HCC nm23是结构及功能上保守的核糖核苷二磷酸激酶家族的一员，在人体中存在着两种nm23基因：nm23-H1和nm23-H2。nm23-H1作为肿瘤转移抑制基因，它与表达量与HCC的转移成负相关。nm23-H1表达的丧失与转移的程度相关，也与几种人类的癌症的不良临床预后相关。Boissan等[31]通过在人肝癌细胞中沉默nm23-H1基因，调查了其对与癌症发展相关的细胞黏附、迁移、侵袭、信号传导的影响。该团队发现了NM23-H1的沉默破坏了由E-钙粘蛋白介导的细胞与细胞的黏附，导致了β-连环蛋白核移位和T细胞因子/淋巴增强因子-1反式激活。此外，NM23-H1沉默通过促进侵袭伪足形成和上调几种基质金属蛋白酶(包括膜型基质金属蛋白酶-1)来促进细胞扩散、提高运动性和加强细胞外基质入侵。总之，他们的研究揭示了NM23-H1对于控制上皮癌侵袭性程序早期阶段细胞与细胞之间的黏附以及细胞迁移至关重要，并且可以形成障碍阻止原位癌转化为侵袭性恶性肿瘤。至于NM23-H2，关于它的研究少于NM23-1，其亚细胞定位主要在胞质中，而在细胞核内较少。Lee等[32]将稳定表达NM23-H2的NIH3T3成纤维细胞和HLK3肝细胞种植在无胸腺的小鼠中，使之产生了肿瘤并显示c-Myc过表达。此外，NM23-H2也增加了NF-κB和cyclin D1的表达。该实验组为了达到沉默NM23-H2基因的目的，通过构建shRNA慢病毒载体抑制了来自HLK3细胞且稳定表达NM23-H2的异种移植肿瘤的生长。总之，这些结果都提示了NM23-H2可能在肿瘤发生过程中充当原癌基因的角色。

2.1.5 SIRT6与HCC SIRT6是NAD+依赖的脱乙酰化酶Sirtuin家族的一员，参与调节基因组稳定性、端粒完整性、转录和DNA修复，且与慢性炎症、糖尿病、肝功能障碍、癌症等相关。因为其复杂而又对立的功能角色，SIRT6被认为是健康和疾病的双刃剑。近年来SIRT6被发现与多种癌症的进展有关，一些研究认为SIRT6在结直肠癌、胰腺导管腺癌、头颈癌中可能是一种肿瘤抑制基因，而另一些研究则表明SIRT6在皮肤癌、前列腺癌中可能是一种原癌基因，但是否与HCC相关，目前还不清楚。Ran等[33]通过实验揭露了SIRT6在HCC中作为原癌基因的角色，SIRT6通过抑制BCL2相关的X蛋白(BAX)表达以及线粒体转位来加强凋亡逃逸。近期他们进一步阐释了SIRT6在HCC中可以阻断BAX的线粒体移位，并通过Ku70的脱乙酰化来降低HCC细胞的凋亡率[34]。同样，Lee等[35]的研究表明SIRT6通过防止DNA损伤和细胞衰老而起到肿瘤启动子的作用。综上，我们看到了SIRT6作为治疗HCC的潜在靶点的希望，不过其机制需要更多的研究来完善。

2.2 单核苷酸多态性(SNP)与HCC SNP是指基因水平单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性，是人类最常见的可遗传基因变异。SNP作为标志物广范围分布于基因中，我们不仅可以从中反映出不同人种、人口、个体的基因差异。同样也可以在疾病的风险评估、早期诊断、预防、治疗等方面发现它的价值[36]。RYBP蛋白于1999年被发现，可抑制基因转录、调控胚胎发育并在表观遗传调控中发挥作用，之后陆续有研究提示RYBP与多种癌症相关，未见报道与HCC相关。最近，一项有关中国人的RYBP多态性研究表明，在HCC的发病发面，基因型为rs12956的RYBP起保护性作用，而rs2118593能够增加HCC的发病风险；RYBP多态性与环境致病因素之间的相互作用在HCC发展发面扮演重要角色；此外，RYBP的SNPs之间的相互作用也可以增加HCC的患病风险。氧化应激被认为在诱导HBV或HCV感染相关HCC中扮演关键角色[37,38]，它可以引起DNA损伤，从而引发细胞的DNA损伤反应(DDR)。DDR基因的单核苷酸多态性可能影响个体对致癌因素的易感性以及影响DNA修复功效，从而影响患HCC的风险。

2.3 HCC的全基因组分析 基因序列的变异是所有恶性肿瘤发生密切相关的重要分子层次上的原因，我国于数年前加入了国际肿瘤基因组协作联盟(ICGC)所倡导的肿瘤基因组研究并取得了多种癌症相关进展。HCC作为最常见的恶性肿瘤之一同样也进行了此研究。一项来自日本的300例PLC患者的全基因组分析确定了编码区及非编码区的点突变、结构变异(STVs)和病毒的整合。他们发现了与PLC发生相关的突变特征以及经常突变的编码区和非编码区，比如长基因间区非编码RNA基因(NEAT1和MALAT1)、启动子、CTCF结合位点和调控区；分析表明PLC与STVs密切关联，这是因为STVs可反复影响复制时间以及已知PLC相关基因(CDKN2A、CCND1、APC、TERT)和新发现的基因(ASH1L、NCOR1、MACROD2)导致这些基因的表达量发生改变。该项研究强调了全基因组测序在发现变异驱动癌症的发生以及全面了解PLC的分子发病机制的方面具有重要意义[39]。

2.4 miRNAs与HCC miRNAs是一类大小为18～23nt的短链非编码RNA。自第一个miRNA在线虫体内发现后，相继有多种miRNA在不同动植物体内被发现，可调节生物体发育、调控细胞周期、参与细胞炎症、增殖、凋亡等过程。最近也有多项研究表明一些miRNA可能充当抑制肿瘤的功能，而另一些miRNA则可能扮演致癌的作用。抑癌方面，具有组织特异性的miR-122在老鼠和人的总miRNAs中分别占70%和52%，在HCC组织及前临床实验研究中，通过miRNA表达改变的全基因组分析提示miR-122显著降低；微阵列分析也比表明miR-122的下调促进了肝细胞的去分化。miR-122可能通过多个作用靶点与肝细胞炎症、纤维化以及HCC细胞的增殖、凋亡、转移发生联系，但这仅仅是推测，需要更多有关研究来证实。此外，多人最近研究描述了未知的炎症反馈回路，这一过程涉及到参与扩大PLC致癌信号的miRNAs和转录因子。miR-124(单独或与miR-7一起)抑制反馈回路中的IL-6R和NF-κB(Rel-A)的活化，从而抑制HCC的发生。并且miR-124可以由于HNF-4α的丧失而表达减少，这样促进了HCC的发生[40]。此外可能与肝癌发生相关的miRNAs还有miR-194和miR-370、miR-15、miR-26、miR-29、miR-155、miR-21、miR-224等[41]。

流行病学及多项研究表明肝癌的发生是一个由多种因素相互作用，经历多阶段发展而来的的肿瘤。众所周知，HBV和HCV相关的慢性肝损是导致HCC的最重要的原因，其他病因对于HCC的贡献较少。我们要增强公民黄曲霉素公共卫生意识、加强实验室及其监测能力、建立早期预警体系、对农民进行种植及管理能力训练等都是至关重要的。充分理解自噬、炎症、免疫这三者复杂的关系以及他们如何被自噬增强剂所影响，或许可以改善HCC免疫疗法的效果。此外我们应该对发达国家和发展中国家日益增长的肥胖率予以密切关注，可能会导致HCC发病率的意外增加。因为HCC恶性程度较高且治疗后易复发，目前其治疗不尽如人意。机遇与挑战并存是目前肝癌研究的现状，需要我们齐心协力通过对其发病机制等多方面综合且深入的研究，找到治疗HCC的关键靶点，创新治疗方法，相信在不久的将来HCC必将被人类所攻克。

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