线粒体通路、氧化应激在肝脏缺血再灌注损伤细胞凋亡中作用机制的研究进展

李欢，熊静，杨树龙，洪芬芳

(南昌大学，南昌330006)

肝脏缺血再灌注损伤是肝脏缺血再灌注后肝脏功能障碍和结构损伤加重的病理过程,细胞凋亡是其病理特征之一。线粒体是联系细胞凋亡和氧自由基的中心环节，对缺血、缺氧非常敏感，肝脏发生缺血再灌注损伤时，线粒体膜结构的破坏是其导致细胞凋亡的主要原因。同时，线粒体也是肝脏缺血再灌注损伤期间活性氧产生的主要细胞器，活性氧的大量产生超过机体清除能力，机体的氧化和抗氧化系统失衡，导致细胞损伤。研究[1]发现，线粒体通路、氧化应激在肝脏缺血再灌注损伤的发生、发展与转归过程中起重要作用，在介导细胞凋亡中涉及的具体机制复杂多样，是研究的难点与热点。现就线粒体通路、氧化应激在肝脏缺血再灌注损伤细胞凋亡中作用机制的研究进展进行综述。

1 线粒体通路在肝脏缺血再灌注损伤细胞凋亡中的作用机制

由诱变剂﹑化疗药物和电离辐射造成的细胞内不可修复的基因组损伤会激活凋亡的内源通路，即线粒体通路。肝脏发生缺血再灌注时，线粒体结构和功能受损，介导细胞凋亡，其具体的机制涉及线粒体通透性转换孔(MPTP)的开放、细胞凋亡相关蛋白释放和B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)家族蛋白的调控作用等。

1.1 MPTP开放 MPTP是存在于线粒体内外膜之间的一组蛋白复合体，是一种非特异性通道，其分子组成尚未完全清楚。肝脏缺血再灌注引起MPTP开放，水分子和其他小分子内流，导致线粒体肿胀破裂，此时线粒体内的一些酶和凋亡诱导蛋白因子释放，介导细胞凋亡。目前的研究发现，ATP、ADP、活性氧簇、高浓度Ca2+均对MPTP有调控作用。Grossini等[2]提出，左西孟旦可通过与NO产生和线粒体ATP敏感性钾通道功能相关的机制，发挥抗缺血再灌注损伤作用。L-Nω-硝基-精氨酸甲酯(L-NAME)和5HD的预处理可消除其所有作用。氟比洛芬是环氧合酶(COX-1和COX-2)非选择性抑制剂。Fu等[3]证实，在肝缺血再灌注前使用氟比洛芬，可通过抑制线粒体通透性转换和糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的失活来改善线粒体和肝细胞损伤，这为临床应用氟比洛芬保护肝功能提供了实验证据。Cai等[4]研究表明，红景天苷预处理可通过GSK-3β/核因子E2相关因子2(Nrf2)依赖的抗氧化反应和随后增加通透性转换孔阻力发挥对肝细胞的保护作用。然而，使用羧基苍术苷开放通透性转换孔可逆转该保护作用。Sirtuin 1是一个能调节线粒体生物合成的酶。Khader等[5]在大鼠缺血再灌注60 min后，给予Sirtuin 1激动剂药物，结果发现其可恢复线粒体的质量和膜电位，一定程度上减轻了肝脏缺血再灌注损伤。硫化氢预处理显著抑制MPTP开放，从而阻止线粒体相关的细胞死亡和细胞凋亡[6]。

1.2 细胞凋亡相关蛋白释放 肝脏缺血再灌注时，线粒体结构被破坏，很多凋亡相关蛋白因为线粒体膜通透性改变释放到胞质中，直接介导细胞凋亡。目前研究发现的与细胞凋亡相关的蛋白有细胞色素c(Cyt-c)、凋亡诱导因子、核酸内切酶G、线粒体促凋亡蛋白Smac、Omi/HtrA2等。其中与细胞凋亡关系最密切的是Cyt-c的释放。Cyt-c从线粒体释放后，线粒体呼吸链、电子传递受阻，细胞能量供应减少，促进凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1)构象变化并发生同源寡聚化。Cyt-c、dATP、Apaf-1和proCaspase-9组成聚合体，称为凋亡体，凋亡体活化后促进细胞凋亡。Lin等[7]在探讨miR-183在缺血后处理中的保护机制的实验中发现，miR-183在大鼠的肝组织缺血后有强大的作用。miR-183可以抑制Apaf-1的表达，中断凋亡体的形成，抑制凋亡。Strifler等[8]在假设大量甲烷吸入可影响缺血再灌注后肝线粒体的呼吸活性前提下设计实验，结果表明常氧再灌注损伤伴有明显的线粒体膜功能损害、Cyt-c活性增加、活性氧生成增加和细胞凋亡。然而升高的甲烷摄入量能显著防止线粒体功能障碍，减少肝细胞的氧化损伤。

1.3 Bcl-2家族蛋白的调控作用 在线粒体介导的细胞凋亡机制中，Bcl-2家族成员具有重要的调控作用。一方面，Bcl-2家族蛋白可以精确地改变线粒体通透性，形成孔道，使线粒体内容物流出；另一方面，它能够诱导线粒体MPTP的开放，促进凋亡相关蛋白释放。Yang等[9]在兔模型中发现，奥曲肽预处理下调了线粒体代谢酶如NADH2脱氢酶、磷酸丙糖异构酶的活性，减轻了肝脏缺血再灌注损伤。此前他们的研究显示，奥曲肽的保护机制可能与内毒素水平降低、炎症细胞因子TNF-α和IL-1β的下调、肝细胞凋亡的抑制以及线粒体介导的Bcl-2/Bax凋亡途径的调节有关[10]。据此，奥曲肽可能有助于减少肝脏手术或移植后的肝损伤，并有希望作为肝脏缺血再灌注损伤的治疗药物。

2 氧化应激在肝缺血再灌注损伤细胞凋亡中的作用机制

当细胞在受到物理、化学、生物等刺激时，为了适应或抵抗刺激，细胞可产生大量高活性的活性氧簇。细胞中的活性氧过度产生和(或)抗氧化防御机制减弱,导致活性氧的生成和清除之间的平衡失调，机体就会出现氧化应激状态[11]。正常情况下机体内活性氧的产生和清除处于动态平衡状态,对机体并无有害影响。随着对病理生理机制研究的深入，发现随着氧的涌入，氧自由基大量产生和过剩，进而诱发的氧化应激损伤是导致肝脏缺血再灌注损伤非常重要的病理机制之一[12]。活性氧簇过度产生依赖于内质网与线粒体的Ca+传递，不仅直接造成肝细胞氧化损伤，导致细胞凋亡；还可引起脂质过氧化，使机体产生一系列脂质过氧化物，同时影响机体凋亡相关标志物的水平，诱发细胞凋亡。另外，一些氧化应激调节分子如HO-1、Nrf2等可通过某些机制改善机体的损伤。

2.1 脂质过氧化 脂质过氧化是指氧化生物膜的过程。活性氧簇可与肝细胞膜磷脂的多不饱和脂肪酸的侧链反应生成丙二醛(MDA)和4-羟基壬烯酸(HNE)等脂质过氧化物，从而改变细胞膜的通透性，导致细胞凋亡。肝细胞膜的脂质过氧化，导致细胞内膜性结构被破坏，增加了膜的通透性;膜脂质过氧化还促进前列腺素、血栓素、白三烯等生物活性物质的形成，诱发炎症反应[13]。

研究[14]发现，活性氧所致的氧化应激是造成细胞凋亡的关键。超氧化物歧化酶(SOD)为机体主要的氧自由基清除酶之一。肝脏有效血流量下降造成内源性氧自由基清除剂SOD下降,同时SOD合成减少,氧自由基清除不足,反过来又进一步抑制SOD的活性。SOD活性下降引发脂质过氧化物在金属离子存在下催化裂解，使MDA产生增多, MDA对细胞有毒性作用,可与蛋白质分子内和分子间交联,诱发细胞凋亡。

异丙酚和七氟醚是临床常用麻醉药，在器官缺血再灌注中有保护作用。Xu等[15]发现异丙酚和七氟醚可通过降低MDA、NO和SOD的释放而减弱氧化应激反应，从而保护肝脏缺血再灌注损伤。香芹酚，精油中常用的食品添加剂，具有抗菌、抗肿瘤和抗抑郁的作用。Suo等[16]研究表明，香芹酚可通过显著降低SOD活性和MDA含量，并恢复过氧化氢酶(CAT)活性和谷胱甘肽(GSH)的含量，对缺血再灌注损伤大鼠有抗氧化保护作用。该结果表明，香芹酚能减轻缺血再灌注诱导的肝损伤，其抗氧化和抗凋亡活性值得进一步研究。Cahova等[17]通过二甲双胍治疗急性应激诱导的炎症反应，结果发现血清AST、ALT活性和脂质过氧化水平降低。该实验结果表明，二甲双胍在降低线粒体性能的同时，可保护肝脏缺血再灌注损伤。他们提出二甲双胍作用的有益效果是基于三个机制：提高抗氧化酶活性、降低线粒体活性氧簇的产生、减轻缺血后的炎症。

2.2 内质网应激 当机体活性氧簇的增加超出了机体的抗氧化能力时，可诱发内质网应激。在氧化应激状态下，大量的活性氧簇产生并且释放，作用于内质网上Ca2+通道，使Ca2+增加，其进入线粒体后干扰电子呼吸链，导致更多的活性氧簇产生[18]。如此反复，恶性循环，诱发和加重内质网应激，从而诱发炎症或细胞凋亡。

Sun等[19]发现，N-乙酰半胱氨酸(NAC)治疗可显著降低活性氧簇水平和活性氧簇诱导的缺血再灌注损伤。NAC处理的小鼠对活性氧簇介导的内质网应激有明显的抑制作用。此外，NAC治疗能显著降低再灌注后Caspase-3活性和细胞凋亡，这与Bcl-2和Bcl-xl蛋白表达有关。同样，NAC处理显著抑制H2O2或TG处理的肝细胞的LDH释放。该研究提出NAC抑制活性氧簇介导的内质网应激可能是抑制内质网应激相关凋亡通路的关键。此外，Wang等[20]提出，NAC也可通过影响JNK信号通路防止肝脏缺血再灌注损伤诱导的自噬和凋亡，其机制可能涉及清除活性氧簇，减少JNK和p-JNK，间接升高Bcl-2水平及改变Beclin 1和Bcl-2的平衡。Xu等[21]证实葡萄籽原花青素(GSP)具有抗氧化、抗炎作用，并可以通过减轻内质网应激信号通路调节保护肝脏缺血再灌注损伤，具有抗凋亡作用。

2.3 凋亡相关标志物水平变化 肝脏缺血再灌注损伤可使血清中ALT、AST、GGT水平增加，GSH和p-Akt减少，使坏死肝中MDA、TNF-α、Caspase-3水平增加，Bcl-2的表达降低，炎性细胞浸润。

茶多酚(TPS)是一类具有较强抗氧化性的物质。Tao等[22]研究结果表明，TPS预处理可减轻小鼠缺血再灌注损伤后ALT和AST活性的上调。此外，GSH在去除人体组织中的活性氧方面起抗氧化剂的作用，而氧化型谷胱甘肽可以通过谷胱甘肽还原酶转化为GSH。在本研究中，TPS通过抑制缺血再灌注诱导的氧化损伤及肝细胞凋亡，从而减轻肝脏缺血再灌注损伤。Xu等[23]研究发现，谷氨酰胺(Gln)预处理后肝组织形态明显改善，GSH、Caspase-3 mRNA水平升高，MDA、SOD、IL-1β和TNF-α水平下降，Bcl-2蛋白表达上调，细胞间黏附分子-1和Bax蛋白表达下调。Gln预处理显著改善了肝脏缺血再灌注损伤后梗阻性黄疸大鼠的肝细胞结构和功能，其保护作用是通过抑制活性氧的产生和炎症反应以及减少肝细胞凋亡介导的。

研究[24]表明，维生素D处理组大鼠ALT、AST、GGT、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB、Bcl-2、cyt-c及Caspase-3水平明显低于I/R组，GSH-Px和Bcl-2水平高于I/R组。组织学检查显示，与I/R组相比，维生素D组损伤肝组织较少，凋亡征象改善。维生素D补充剂主要通过减轻由氧化再灌注损伤介导的炎症-细胞凋亡反应来改善肝缺血再灌注损伤。

Huang等[25]研究了异甘草酸镁(MgIG)对缺血再灌注损伤诱导的人类肝L02细胞氧化应激和凋亡的影响。实验结果表明，MgIG治疗显著降低凋亡细胞数量、细胞凋亡相关蛋白的表达，并减轻了肝细胞损伤。MgIG还可对抗缺血再灌注诱导的氧化应激，因为它有效地减少了MDA表达，并升高了SOD和GSH-Px活性。LO2细胞经MgIG处理后，p-AKT和p-ERK蛋白的表达增加，表明MgIG的保护作用可能激活了Akt和ERK信号通路。

2.4 氧化应激调节分子变化 ①血红素加氧酶-1(HO-1)。HO-1又称热休克蛋白-32，是一种微粒体酶。HO-1在氧化应激、炎症等过程中发挥重要作用。当机体发生应激损伤时可诱导HO-1的表达。Fang等[26]对缺血再灌注损伤大鼠使用PEG-hemin治疗，结果发现与对照组比较，PEG-hemin治疗可改善大鼠肝血流量，显著提高HO-1的表达和酶活性；HO-1通过活性氧簇机制改善了肝脏功能，减少了肝细胞凋亡和炎症细胞因子产生。②转录因子Nrf2。Nrf2介导的信号通路是抗氧化的关键信号通路[27]。正常情况下，绝大部分Nrf2与胞质kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)结合，以非活性状态存在于细胞质中，通常Nrf2表达量维持在较低水平，但在氧化应激的作用下可与Keap1解离而进入胞质。MnDPDP预处理的肝脏表现出Nfr2和HIF-1α途径的激活，导致更高的CAT和HO-1活性[28]。MnDPDP还增加了总氮氧化物产生，其源自组成型一氧化氮合酶的较高表达和诱导型一氧化氮合酶的较低表达。Chi等[29]实验发现，萝卜硫素(SFN)预处理能通过激活Nrf2/ARE信号转导通路减轻肝脏缺血再灌注损伤，减轻氧化应激，维持Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的正常活性，从而减少细胞凋亡的发生。硫化氢可以改善肝脏缺血再灌注损伤，但确切的机制仍不清楚。Shimada等[30]研究提出硫化氢钠通过涉及Nrf-2机制和Akt-p70S6k加速肝再生的机制，发挥直接和间接的抗氧化活性并加强促生存、抗凋亡、抗炎的作用，改善肝脏缺血再灌注损伤。

综上所述，线粒体通路和氧化应激是肝脏缺血再灌注损伤细胞凋亡的重要机制，其具体的作用途径也逐渐清晰，这为临床治疗提供了强有力的理论支持，可以指导临床针对这一损伤机制制订肝脏缺血再灌注损伤的预防和治疗方案，比如预处理给药抑制MPTP开放或者抑制活性氧的过度产生等，但具体的实施方案还有待更多的实验研究。