长链非编码RNA H19基因多态性与高尿酸血症发病风险的关系

张晓春，胡巍娜，王琦

(中国医科大学附属第四医院，沈阳 110032)

尿酸是嘌呤的代谢产物，尿酸产生增多或者尿酸排泄减少可引起血尿酸水平升高。持续的高尿酸血症会对人类健康造成严重的危害。有研究表明，高尿酸血症是心血管疾病、代谢综合征、糖尿病、高血压病、慢性肾病等一系列慢性疾病的独立危险因素[1]。尿酸的代谢不仅与饮食、生活方式等因素有关，而且与基因、遗传等因素密切相关[2]。长链非编码RNA(LncRNA)是目前生命科学研究领域中的热点。尽管LncRNA通常不直接参与编码蛋白，但其却可以在细胞生命活动过程中发挥重要的调控功能[3]。H19基因长度约为2 300 bp，缺乏开放阅读框架，不具有蛋白编码功能，属于LncRNA基因家族的重要成员之一[4]。有研究表明，H19广泛参与各种病理生理过程的调控，例如H19在胃癌[5,6]、膀胱癌[7]、胰腺癌[8]等多种肿瘤中高表达，发挥癌基因功能，在前列腺癌[9]中低表达，发挥抑癌基因功能。特别值得注意的是，有研究者证实，H19基因的突变(rs217727和rs2067051)与冠心病的发病风险存在密切关系[10]。然而，H19基因是否与高尿酸血症发病有关目前还没有被证实。本研究通过对高尿酸血症患者和正常对照人群外周血中H19基因的基因型进行检测，探讨H19基因多态性与高尿酸血症发病风险的关系，为高尿酸血症的早期诊断提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2011年4月～2012年6月，于中国医科大学附属第四医院体检中心进行健康检查的社区居民共187例，入选人群均签署知情同意书。排除标准：各系统疾病的急性期，严重感染、急性创伤、有恶性肿瘤病史、严重肝肾功能不全、血液系统疾病、免疫性疾病等炎性疾病、有精神系统疾病等其他各脏器疾病史。187例入选人群中高尿酸血症者35例(高尿酸血症组)、尿酸正常者152例(尿酸正常组)。高尿酸血症诊断标准参照《高尿酸血症和痛风的治疗的中国专家共识》[2]，即男性>420 μmoL/L(7 mg/dL)、女性>360 μmoL/L(6 mg/dL)。高尿酸血症组男31例、女4例，年龄(54.97±6.60)岁，BMI 26.84±2.99，收缩压(129.31±15.46)mmHg，舒张压(81.13±10.95)mmHg，心率(76.49±11.15)次/min，TC(5.42±1.14)mmol/L，TG(2.74±1.58)mmol/L，LDL-C(3.14±0.86)mmol/L，HDL-C(1.18±0.30)mmol/L，肌酐(92.55±15.10)mmol/L，空腹血糖(5.65±1.24)mmol/L；尿酸正常组组男113例、女39例，年龄(55.59±5.93)岁，BMI 25.48±3.02，收缩压(129.96±16.48)mmHg，舒张压(77.87±10.19)mmHg，心率(77.87±11.56)次/min，TC(5.27±0.97)mmol/L，TG(2.17±1.66)mmol/L，LDL-C(3.20±0.80)mmol/L，HDL-C(1.32±0.31)mmol/L，肌酐(81.28±14.04)mmol/L，空腹血糖(5.80±1.57)mmol/L；两组性别、HDL-C、肌酐比较P均<0.05，其他指标比较差异无统计学意义。

1.2 LncRNA H19单核苷酸多态(SNP)位点基因型检测 抽取所有入选人群空腹左肘前静脉血3 mL，用EDTA抗凝管收集，用于提取DNA。利用HapMap数据库对基因多态性进行筛选。采用Haploview4.2选择中国北京汉族人群(CHB)连锁不平衡r2值大于0.8，且最小等位基因频率(MAF)大于5%。采用F-SNP软件(http://compbio.cs.queensu.ca/F-SNP/)对这些入选位点的可能功能进行预测。最后所选的3个SNP分别为rs2735971A/G(突变位于H19内含子区，MAF=0.133)、rs2839698C/T(突变位于H19内含子区，MAF=0.2929)、rs3024270C/G(突变位于H19内含子区和3′UTR 区，MAF=0.3654)。应用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒从200 μL外周血中提取基因组DNA。操作严格按照说明书步骤要求，DNA提取在中国医科大学附属第四医院中心实验室内完成。为将包有含待测SNP及其部分上游及下游侧翼序列的DNA片段通过PCR方法扩增出来。扩增使用的PCR引物序列如下(5′-3′)：rs2735971为CATGTGTATTTC-TGGAGGCTTCCCCTTCAGTCTCACCGCCCGGATGGC-ACRGAATTGGTTGTAGTTGTGGAATCGGAGGTGGC-TGCGCGGCGGCAGTGCAG；rs2839698为CTCGAGG-CAGGGCTGGTGGGGCCTGAGGCCAGTGAGGAGTG-TGGAGTAGGYGCCCAGGCATCGTGCAGACAGGGC-GACATCAGCTGGGGACGATGGGCCTG；rs3024270为GGACGCGGCCCTGCCCAGACCGCCCCGCCGGGC-CACCATCTCACTGCCCCVACCTCTGTCTTCTACAGA-ACACCTTAGGCTGGTGGGGCTGCGGCAAGAAG。将提取的外周血DNA送至上海贝晶生物技术有限公司通过使用竞争性等位基因特异性PCR技术(KASP)进行了基因型检测。

1.3 统计学方法 应用SPSS18.0进行统计。基因多态性位点与高尿酸血症发病风险的关系分析采用多重回归模型，计算风险比(OR)和95%可信区间(CI)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

H19基因3个SNP位点均符合哈德-温伯格平衡。两组H19基因不同基因型分布见表1。H19基因3个SNP位点等位基因频率分布见表2。多重回归模型结果显示，与rs2735971 GG基因型相比，GA基因型高尿酸血症发病风险高(P=0.034，OR=1.959，95%CI：1.051～3.652)；与rs2735971 G等位基因相比，A等位基因高尿酸血症发病风险低(P=0.001，OR=0.033，95%CI：0.005～0.241)；与rs2839698 TT基因型相比，CC基因型高尿酸血症发病风险高(P=0.012，OR=3.639， 95%CI：1.329～9.959)；与rs2839698 T等位基因相比，C等位基因高尿酸血症发病风险低(P=0.000，OR=0.268，95%CI：0.161～0.447)。

表1 两组H19基因不同基因型分布(例)

表2 两组H19基因3个SNP位点等位基因频率分布(%)

3 讨论

近年来，高尿酸血症的患病率呈逐年上升态势，在某些沿海或者发达地区，高尿酸血症患病率为5%～23.5%[2]。目前认为环境、生活方式遗传等多种因素可以影响血尿酸水平，其中遗传相关的因素在高尿酸血症发病中的作用越来越被研究者关注。以家族为基础的一系列研究表明，尿酸水平的高低大概25%～75%归咎于基因[11,12]。在中国男性人群中的研究发现，P2RX7基因位点rs2230911可以显著增加罹患高尿酸血症的发病风险，其中等位基因G与等位基因C比较增加了罹患高尿酸血症发病风险的1.755倍[13]。一项在欧洲人群中进行的GWAS研究检测SLC2A9基因相关的3个SNP位点(rs6832439、rs13131257、rs737267)，发现SLC2A9基因多态性与高尿酸血症的发病可能相关[14]。然而，LncRNA基因是否影响高尿酸血症目前鲜见文献报道。

H19基因位于人染色体11p15.5区域，是典型的母系等位基因表达、父系印迹的基因[15]，在人类和啮齿目动物进化过程中呈现高度保守状态。它包含有5个外显子和3个内含子，具有多个C/EBP转录因子家族的结合位点[16]。H19基因上游有包含有一个差异甲基化区(MDR)，也称印迹控制区。该控制区可以通过对其CpG位点甲基化来实现基因表达的控制。通常情况下，H19基因上父系的基因拷贝被甲基化而被沉默，而母系的基因拷贝不被甲基化而选择性表达。H19基因虽然不能直接编码蛋白质，但其可以作为调节性的RNA发挥作用[17]，也可以参与编码微小RNA[18]，参与调节肿瘤发生[5～9]、细胞生殖[19]等病理生理过程。此外，部分研究发现，H19基因的突变与冠心病[10]及多种恶性肿瘤[20～22]的发病风险密切相关。我们的研究探讨了H19基因的3个主要SNP位点(rs2735971、rs2839698、rs3024270)与高尿酸血症发病风险之间的关系。

rs2735971是H19基因上游MDR区核苷酸A/G的变异，该SNP位点在中国汉族和朝鲜族人群中具有较高的检出率,是比较可靠的遗传标记[23，24]。Li等[20]对该位点与中国汉族结肠癌患者发病情况进行了分析，但未发现该SNP位点与结肠癌发病风险相关。我们发现，rs2735971多态的GA杂合型增加了患高尿酸血症的发病风险，这说明GA杂合型可能是高尿酸血症的患病风险；A等位基因降低了患高尿酸血症的发病风险，这说明A等位基因模型可能是高尿酸血症的保护因素。rs2839698是H19基因外显子区域核苷酸C/T的变异，rs2839698与多种恶性肿瘤的发生密切相关。Li等[20]发现，rs2839698显著增加中国汉族人结肠癌发病风险，并且与结肠癌的恶性程度显著相关。Yang等[21]发现，rs2839698多态增加胃癌的发病风险，并且CT和TT基因型携带者外周血中H19的表达水平较CC基因型呈现显著的升高。然而，Verhaegh等[22]却发现rs2839698多态CT基因型能降低膀胱癌的发病风险。本研究发现,rs2839698位点C等位基因显著降低了罹患高尿酸血症的发病风险，提示C等位基因是高尿酸血症的保护因素，但是基因型分析却发现CC基因型较TT基因型增加了罹患高尿酸血症的发病风险，提示CC基因型是高尿酸血症的风险因子。我们推测rs2839698影响高尿酸血症的发病可能是由于该位点突变改变了H19基因的二级结构有关[25]。rs3024270是内含子区域核苷酸C/G的变异，在本研究中未发现该位点多态性与高尿酸血症发病风险存在相关性。

本研究仍存在有一定的不足之处：其一，本研究纳入研究的样本量较小，所得结果有待多中心大样本的研究来进一步证实；其二，本研究两组人群存在性别比例的差异，这可能会对研究结果造成一定程度的影响。

综上所述，LncRNA H19基因rs2735971、rs2839698位点多态性可能与高尿酸血症的发病风险存在相关性，这两个位点可能是高尿酸血症潜在的分子生物学标志物。