组织工程皮肤及其生物反应器的研究进展

王洋，伍津津

(1中国人民解放军第211医院，哈尔滨 150001；2中国人民解放军陆军军医大学大坪医院)

20世纪80年代提出了组织工程这一新概念，其已发展成为一门新兴的学科。当前组织工程的研究核心是将生物材料与有生物学活性的组织细胞相结合，实现体外构建组织与器官，从而达到维持、修复、改善或再生损失组织与器官的功效。因此，组织工程是一门生物科学与工程科学紧密结合的前沿学科。如何在体外构建组织和器官从而来模拟体内生理条件的三维环境是极其重要的。van Wezel[1]于20世纪60年代最先借助微载体法成功悬浮培养出了动物贴壁细胞。可见在生物反应器中，基于微载体法进行体外大规模扩增动植物细胞是最常用，且最有效的途径。近年来，组织工程生物反应器研制取得了重大突破，其形式多样，如搅拌式、中空纤维式、气升式、单轴和双轴旋转壁式等[2]。目前，组织培养生物反应器已在骨和软骨组织工程、人体干细胞大规模体外扩增、组织工程皮肤和其他人体器官修复领域得到广泛重视。现就组织工程皮肤及其生物反应器的研究进展情况做一综述。

1 组织工程皮肤

皮肤由表皮、真皮和皮下组织组成，是人体最大、最复杂的器官，其功能不只是人体的屏障，还包括免疫、内分泌、生理代谢、神经传导等生理功能[3]，而皮肤缺损是一种常见的组织损伤性疾病[4]。与正常皮肤组织一样，组织工程皮肤包含角质层、表皮层和真皮层等，其出现为大面积皮肤缺损患者的治疗提供了一种新的有效方法[5]。目前，组织工程皮肤主要有人工表皮替代物、人工真皮替代物、人工复合皮替代物。

1.1 人工表皮替代物 表皮细胞的成功培养为组织工程皮肤的研究奠定了基础[6]。在组织工程皮肤的构建及烧伤、慢性创面治疗过程中，表皮细胞尤为重要，是实现创面上皮化的关键细胞。患者自身的表皮细胞是创面治疗的首选，然而在短时间内大规模获取及大量扩增表皮细胞受到一定的阻碍，这使得组织工程皮肤及表皮细胞膜片等的应用存在困难。从培养模式及培养基的选择考虑，表皮细胞的培养主要分为有、无滋养层培养及有、无血清培养和体内、外培养。Ronfard等[7]以纤维蛋白基质为载体，培养了自体表皮细胞，并将其用于Ⅲ度烧伤患者创面的修复，实现了上皮层的重建。人工表皮替代物的临床应用虽取得了一定的成功，但总体由于缺少真皮结构，单纯表皮膜片用于创面修复时，尤其是用于较深的全层皮肤缺损修复时，暴露出了不少问题与缺陷，如易破碎、抗感染力差、移植后易形成水泡等，因此难以达到理想的功效。

1.2 人工真皮替代物 在皮肤重建过程中，真皮替代物扮演重要角色，如增加创面愈合后的皮肤弹性、柔软性及机械耐磨性等，减少瘢痕增生；此外，有些真皮替代物中存在的活性纤维母细胞(Fbs)可促进表皮生长分化，从而诱导基底膜的形成。因此，人工真皮的研制一直是组织工程皮肤领域的研究热点之一。目前，人工真皮替代物主要有异体脱细胞真皮替代物、合成基质真皮替代物和异体Fbs真皮替代物。在某些方面，真皮替代物很好地弥补了表皮替代物的缺陷，具有较好的应用前景，但它仍有一些问题，如水分易丢失，需二次表皮移植等。

1.3 人工复合皮肤 人体的正常皮肤是由表皮和真皮所构成，也就是说无法用单一的表皮替代物或真皮替代物来代替，从而实现皮肤结构和功能的完整性。因此，所开发出的理想人工皮肤替代物应同时具备表皮和真皮两种结构，即应当是一种复合型的皮肤替代物。当前，已开发出的最为成熟的Apligraf人工复合皮肤，是含有Fbs和异体上皮细胞的双层组织工程皮肤[8]。

2 组织工程皮肤生物反应器

2.1 当前组织工程皮肤培养面临的问题及解决方案 组织工程皮肤中的核心工作主要有体外培养与扩增种子细胞、制备胞外支架材料、构建与移植人工皮肤组织。然而制约人工皮肤组织研究、发展及其产业化的关键因素主要有种子细胞数量不足、细胞功能老化(长期传代所诱发的)等问题。所以，现阶段亟需解决的技术“瓶颈”就是如何制备大量且高质量的皮肤种子细胞[9]。通常，先将皮肤种子细胞接种至支架材料上，构建了工程化的组织，然后经过一定时间的体外培养，实现细胞的增生、分化以及外基质的分泌，使其成熟后才可以移植。目前，最常用的方法是定期换液静态培养法(即为批式培养)，即通过移去旧培养液的方式进行，优势是具有个体化的特点；但缺点显而易见，一是培养液的消耗呈进行性下降，而代谢产物不断增加，一方面会对细胞造成一些生理性损伤，影响三维构建物的功能形成，另一方面会造成pH上升，对细胞的生长、增殖和分化等有一定的影响；二是通过换液后又使培养液的营养成分呈现出周期性的波动，不利于细胞的均匀生长和增殖；三是这种批式静态培养主要依靠人工操作，劳动强度大，工耗高，效率低，只适用于实验室级的培养，不适合大批量生产；四是依靠弥散方式提供营养，存在营养供应受限的显著缺点，尤其是构建内部的细胞得不到营养，造成死亡[10]。目前解决这一问题的有效方法是通过生物反应器来改善其传质过程。众所周知，天然皮肤有低应力环境和与空气直接接触的特点。因此，工程化皮肤组织的首要条件是需要气液界面培养，其次才是提供一个相对低的应力环境。可见，一个具有灌流腔室的生物反应器可实现上述功能：培养基的连续供给和气液界面的维持[11,12]。灌流室模型的生物反应器是灌流室及其上方的半透膜所构成的。半透膜的上部空间主要用于表皮细胞的培养或组织工程皮肤的构建[13，14]。

2.2 灌注式生物反应器类型 用于组织工程皮肤培养的灌注式生物反应器，其结构由培养室和进出管路(用于循环培养基)组成。由于培养室的可操作空间非常小的缘故，通常将氧合作用在生物反应器的外部进行，也就是说氧合后的培养基通过管路系统进入培养室。目前，最简单的灌注式生物反应器由一个培养室(通常为长方体形)、一个入口管路和一个出口管路所组成；其次，从概念设计层面来说，可设计多个培养基的进出口，其在培养室壁面上的分布多样化，且可优化培养室的形状。根据研究对象的不同，学者们设计了多种适用于组织工程皮肤的灌注式生物反应器。用于种子细胞扩增的生物反应器，包括小规模、大规模扩增种子细胞的装置。常用的有转瓶、多层托盘或多层繁殖器、微载体法的搅拌生物反应器。

2.2.1 Kerator反应器 在组织工程皮肤中，研究[10～12]首先成功研制了用于角质形成细胞扩增的生物反应器。这是一种五层式的角质形成的细胞培养装置，由单个独立的培养室重叠在一起，每层的培养面积达到630 cm2，层与层之间通过管路连接，扩增培养的角质形成细胞从增生、构建双层皮肤等方面与方瓶培养没有差异。其优点是实现了角质形成的规模化扩增，消化传代、换液、培养实现程序化，装配有显微镜图像采集系统供细胞生长观察。其缺点也很明显，一是管路过多，给装置的清洗和消毒造成一定的困难，二是体积过大，三是扩展性差，四是装配较复杂，不便操作。

2.2.2 双重功能的生物反应器 Sun等[15]设计了一个具有双重功能的封闭系统。此系统不仅可用于种子细胞的接种，还可用于气液界面的培养，由培养室、支持架、支架基质、细胞接种网格和接种环、管路等组成，支架基质由支持架支撑，浮在培养液上，表面有4个或9个接种室来接种细胞，液体通过侧面的管路实现循环(流速为0.5 mL/h)；该培养系统可做连续灌注或批式培养，支架基质可为脱细胞的真皮基质、电纺丝的聚苯乙烯或聚苯乙烯与聚乳酸的电纺丝复合物。

2.2.3 MINUTH灌注式培养容器 Kremer等[16]采用的是MINUTH灌注式培养容器，其结构原理和Sun等[15]的有一些类似之处，但为浸没培养而不是气液界面培养，没有细胞接种网格和接种环，灌注速度为1 mL/h；将角质形成细胞接种到人工真皮模板上灌注培养5 d以上，并移植到裸鼠，结果表明从组织学上看与静态培养区别不大，但有明显改善细胞生长，对伤口的黏附性好并达到完全愈合。

2.2.4 Kalyanaraman型生物反应器 Kalyanaraman等[10]设计则完全不同，为了保证工程化组织的气液界面培养，管路是从培养室底面开口，通过管子的高度来控制液面高度，液面溢出管子高度后才流出来；采用此培养系统对构建的组织皮肤替代物进行熟化培养。研究表明，在灌注速度为5、15 mL/min培养条件下，组织学结构好于静态培养；检测结果表明5 mL/min的灌注速度明显好于静态培养；同时通过细胞增殖检测法(BrdU掺入法)检测细胞的增生情况也表明在5、15 mL/min时明显好于对照，而50 mL/min时只显示少量增生，结果证明低流速能够增加细胞活力和维持表皮的屏障，适合于移植，而高流速则导致细胞的变性坏死。

2.3 灌注式培养的优点 温旭红[11]运用两步酶消化法分离培养人的角质形成细胞、成纤维细胞，制备含有毛乳头细胞凝胶球的组织工程双层细胞，并通过灌注式生物反应器进行动态培养。在与静态培养结果分析对比发现，在灌注培养中毛乳头细胞凝胶球与组织工程皮肤(由人的角质形成细胞、成纤维细胞所构建的)更好地契合，并能形成类似“毛芽”的结构，这充分说明了灌注式生物反应器较静态培养更适合于组织工程皮肤的培养。周燕等[18]实验研究皮肤成纤维细胞在方瓶、转瓶和生物反应器中的生长和扩增，发现采用相同微载体浓度的前提下，在所获得的最大细胞密度方面，基于生物反应器培养方式是基于转瓶培养方式的1.43倍，同时是基于方瓶静止培养方式的9.16倍；此外，在细胞的比生长速率方面，基于生物反应器培养方式是基于转瓶培养方式的1.88倍，是基于方瓶培养方式的3.98倍。同时基于生物反应器培养方式的倍增时间最短，从而显著地减少了培养周期，且传代培养一次，细胞扩增高达29.7倍，但在转瓶和方瓶培养方式中进行传代培养一次，细胞扩增却只有18.6倍和4.54倍。然而最为重要的一点是，采用生物反应器培养系统可以显著增大种子细胞的扩增效率。借助微载体与生物反应器来悬浮培养皮肤成纤维细胞，可有效并迅速地制备大量的种子细胞，从而为大面积皮肤组织的构建提供了重要保障。上述研究表明灌注式培养有显著的优点：①克服了营养物质传递受到限制的缺陷，这是因此培养基可以连续地流经三维构建物内部或周围，从而更接近体内的生理特点；②当构建物厚度超过500 μm时，营养供应也可以得到保障；③液流可产生一定大小的剪切力，从而提供一定的机械刺激，对构建物的发育与成熟是极其有利的；④三维构建物一直处于新鲜的培养液中，这极其有效地避免了细胞因子的旁分泌作用过度和代谢产物的非生理性累积[19]。因此，灌注式培养已成为组织工程最有前途的培养方式。

2.4 未来发展趋势 由于皮肤组织的特殊性，体外培养时与其他组织器官显著不同的是要求气液界面培养条件，这意味着表皮层的营养和氧供应须通过真皮层的渗透而来，表皮层表面接触空气才利于角质形成细胞的分化和角质层形成。这几种用于组织工程皮肤培养的方案都是采用灌注培养，虽然部分装置实现了气液界面培养，但都存在比表面积小、扩展性差、结构复杂和流场不均匀等缺点。由于流场不均一，存在营养传递不均的现象，边缘液体不易流动，容易造成细胞坏死；由于流场对细胞的剪切力不同，势必对细胞的功能产生不同的影响，Kalyanaraman等的结果也充分说明了这一点，在高流速(50 mL/min)情况下细胞的活力反而不如低流速(5 mL/min)并出现变性坏死。此外，这些培养装置的灌注速度是通过实验摸索出来的，缺乏数值模拟分析，其操作条件和培养室结构还需要进一步优化。而解决这些问题的根本手段就是需要引入工程学的原理和手段，Matin等认为应通过模拟的方法来预测生物反应器系统所提供的最佳液流环境，而不是通过反复的实验来确定[20]。Wendt等[21]认为，生物反应器的操作模式应该是在将实验资料与计算模型整合的基础上所建立的，而不是在不断试错的基础上所建立的。因此，将支架内流场分析和生物学实验结果相结合，可以设计出更为高效的支架微结构或生物反应器，从而构建出更出色的工程化组织；与此同时，可基于计算机模拟来预测不同支架材料所需的最佳液流环境。因此，目前计算流体力学(CFD)在生物反应器设计和细胞培养要求等方面显示出非常重要的意义，其数学建模涉及到流场、细胞生长、细胞外基质合成、流加灌注培养策略等许多内容，以达到维持最佳营养环境的目的。利用CFD可以分析生物反应器内流体的运动状态及其流场特征等参数[22]、计算三维支架材料内部及表面的流体剪切应力、绘制氧分布图；此外，还可依据培养基的流动速度与剪切力分布特性来推算培养物的生长状态，进而优化生物反应器[23]。针对已投入使用和正在设计的组织工程皮肤灌流式生物反应器，胡信雷开展了数值模拟研究，结果发现：灌流式生物反应器的良好模式是圆柱形双灌流模式。王瑞[24]利用CFD技术对灌注式培养器低速和高速流场的均匀性与剪切力进行模拟分析，发现低速(80 mL/min)条件下，营养液速度、动静压、流场旋涡度、速度梯度、流场矢量等指标能够保证很好的均匀性。

综上所述，随着组织工程皮肤的不断深入研究与迅速发展，生物反应器必将展现出其独特的优势，并引起广泛关注。此外生物反应器的高速发展，也必将促进组织工程皮肤的进一步发展。研究表明，人工组织和器官的性能与质量取决于细胞培养和体外组织所构建的条件和环境是否解决体内细胞的实际发育情况。当前，生物反应器在组织工程皮肤中发挥了重要作用，但仍存在很多亟需解决的问题，如：①人体正常皮肤在组成、结构和功能等方面的高度复杂性对模拟细胞外基质成分的人工皮肤支架提出了更高的要求，如需要良好的生物活性、生物相容性和力学性能；②组织工程复合皮肤展现出了与正常人体皮肤相近的结构和功能，具备了正常皮肤的附属器官，且可促进快速血管化(皮肤移植后)，并提高移植成功率。因此，组织工程复合皮肤是未来组织工程皮肤的重点发展方向；③今后组织工程皮肤领域中，所研制的生物反应器应满足：气液界面培养、低应力环境、低流速、均匀流场等基本要求外，又要具有良好的扩展性、比表面积大、功能更强等特性；生物反应器的传质过程(尤其是氧的传质)极大地限制了生物反应器的放大;④在生物反应器中进行高密度培养时，不均衡的溶氧传质或许会成为制约组织工程皮肤生物反应器构建的关键因素。