EGFR基因敏感突变晚期非小细胞肺癌患者血清c-MET基因表达变化及其意义

李丽娜，徐瑞，王玉珍，陈琳

(1陕西省肿瘤医院，西安710061；2 陕西省人民医院)

近年来，分子靶向治疗在具有驱动基因的晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者的治疗中取得显著疗效，其中最具代表性的是针对表皮生长因子受体(EGFR)的靶向治疗。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)是一种小分子EGFR抑制剂，可通过内源性配体竞争性结合EGFR，抑制酪氨酸激酶的活化，阻断EGFR信号通路，抑制肿瘤细胞的增殖、转移并促进肿瘤细胞凋亡等一系列生物学效应。因此，EGFR-TKI类药物是目前EGFR基因敏感突变晚期NSCLC的主要治疗方法。临床最常用的EGFR-TKI药物为吉非替尼(Gefitinib)，但患者易发生继发性耐药，且部分患者缓解期较短。约50%的继发耐药由EGFR20外显子的T790M突变所致，T790M突变可改变EGFR空间构象，使EGFR-TKIs与EGFR结合受阻，从而导致耐药；另外约20%的获得性耐药与间充质上皮转化因子受体(c-MET)的扩增有关，c-MET通过癌基因ErbB3绕过gefitinib作用靶点，介导PI3K通路持续激活，导致获得性耐药[1，2]。本研究检测了50例EGFR基因敏感突变的晚期NSCLC患者血清c-MET基因表达，分析其与NSCLC患者临床病理参数关系以及与TKI治疗疗效的相关性，旨在为血清c-MET预测EGFR基因敏感突变晚期NSCLC患者临EGFR-TKI治疗的效果提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2014年1月～2017年4月间在陕西省肿瘤医院接受吉非替尼单药一线治疗的EGFR基因敏感突变晚期NSCLC患者50例，其中男22例、女28例，<60岁23例、≥60岁27例；吸烟者21例，不吸烟者29例；肿瘤分化程度为高、中分化20例、低分化30例；腺癌43例(含3例细支气管肺泡癌)、鳞癌7例；按照ECOG一般身体状况评分标准为PS 0～1分者22例；均符合UICC第7版肺癌TNM分期标准，影像学检查初步诊断为肺癌Ⅳ期；均为首次来我院确诊，未接受过任何抗肿瘤治疗；无手术指征。50例患者均穿刺活检取肿瘤组织进行EGFR基因18～21号外显子突变检测，均为19DEL或L858R突变者，确定为EGFR基因敏感突变。根据RESIST1.1评价标准，至少有一个可评价测量病灶，预计生存时间>12周。治疗期间患者仅可接受骨转移止痛治疗和其它对症处理外，不接受其他抗肿瘤治疗和生物治疗。本研究经医院伦理委员会审批通过，患者或家属在入组前均签署知情同意书。

1.2 主要试剂 Pfu PCR MasterMix(天根科技生化有限公司)；E.Z.N.A.®Blood DNA Kit(美国 Omega 公司)；琼脂糖(西班牙 Biowes 公司)；荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)；凝胶成像系统(美国Alpha innotech 公司)

1.3 血清c-MET基因表达检测 50例患者均于吉非替尼治疗前采集空腹外周静脉血3 mL，室温静置6 h，3 000 r/min离心 10 min，取上清，-70 ℃保存备用。采用实时定量PCR法检测血清c-MET表达，提取血清DNA， 紫外分光光度仪测定DNA的OD260和OD280，OD260/OD280值在1.7～2.0为提取DNA合格。合成PCR引物c-MET基因上游引物：5′-TCACATCTCTCACCTCATCTG-3′，下游引物：5′-GAAGGCAGGCATTTCTGTA-3′；内参基因Line-1上游引物：5′-AAAGCCGCTCAACTACATGG-3′，下游引物：5′-TGCTTTGAATGCGTCCCAGAG-3′。退火温度60 ℃。以上引物均由大连宝生物工程有限公司合成。反应体系为20 μL：PCR Mix 10 μL，上游引物(10 μM) 0.5 μL，下游引物(10 μM) 0.5 μL，模板DNA 2 μL，去离子水 7 μL。反应条件： 95 ℃预变性1 min，40个循环，95 ℃10 s；60 ℃30 s。每个样品均设3个复孔以减少实验误差。试剂盒购买自西安化学试剂厂。以2-△△Ct代表c-MET的相对表达量，实验重复3次，取平均值。

1.4 吉非替尼治疗及预后方法 50例患者于首日晚上服用吉非替尼(Iressa,阿斯利康公司产品)250 mg，以后每日早晨空腹服用吉非替尼 250 mg，直至疾病进展或出现无法耐受的不良反应。治疗后观察并记录进展生存时间(PFS)、总生存时间(OS)。PFS定义为首次服用吉非替尼至有客观证据证明疾病进展或任何原因导致死亡的时间。OS定义为从服用吉非替尼开始至任何原因死亡的时间。主要研究终点为0S和PFS。截止研究终点仍未进展或死亡患者以最后一次随访评价时间作为截尾数据。

2 结果

50例患者血清c-MET基因相对表达量为0.046 1±0.011，<60岁、≥60岁者血清c-MET基因相对表达量分别为0.059±0.013、0.043±0.021；男、女性血清c-MET基因相对表达量分别为0.042±0.025、0.056±0.018；吸烟、不吸烟者血清c-MET基因相对表达量分别为0.048±0.016、0.053±0.029；腺癌、鳞癌血清c-MET基因相对表达量分别为0.047±0.019、0.052±0.025；高中分化、低分化者血清c-MET基因相对表达量分别为0.055±0.014、0.052±0.023；血清c-MET表达与EGFR敏感突变NSCLC患者年龄、性别、吸烟情况、肿瘤类型、分化情况间差异无统计学意义(t分别为0.283、-0.835、0.748、0.917、1.063；P均>0.05)。

50例患者血清c-MET基因相对表达量中位数为0.050，以0.050为界限将50例患者分为c-MET高表达组24例、低表达组26例，血清c-MET基因相对表达量分别为0.062±0.014、0.031±0.015，二者比较，P<0.05。

50例患者的PFS、OS分别为11.2、23.4个月，c-MET基因高、低表达组PFS分别为8.5、13.9个月；OS分别为22.9、24.3个月。Kaplan-Meier生存曲线显示，血清c-MET基因相对表达量与EGFR基因敏感突变晚期NSCLC患者吉非替尼治疗后PFS有关(χ2=3.989，P<0.05)，与患者OS无关(χ2=0.712，P>0.05)。

Cox风险回归模型分析结果显示，血清c-MET基因相对表达量是EGFR基因敏感突变的晚期NSCLC患者非EGFR-TKI治疗的独立不良预后因素(P<0.05)。

3 讨论

肺癌是我国发病率和病死率绝对数最高的恶性肿瘤，其中85%以上为NSCLC[3～7]。EGFR-TKIs使NSCLC的治疗从细胞毒药物广谱治疗模式进入个体化、靶向治疗模式[8，9]。EGFR-TKI治疗肺癌的疗效与EGFR突变密切相关。EGFR突变位点主要为18～21外显子，最常见的为19外显子的缺失突变(导致delE746-A750氨基酸残基片段缺失)和21外显子的点突变(L858R氨基酸残基的置换)。EGFR突变可增强NSCLC患者对EGFR-TKI的敏感性。EGFR-TKI是目前EGFR基因敏感突变的晚期NSCLC患者的一线治疗方案。但EGFR基因敏感性突变的NSCLC患者在服用EGFR-TKI治疗8～10个月后也会发生获得性耐药，且部分患者缓解期非常短。因此耐药基因的检测对治疗模式的选择及临床预后判断尤为重要。

c-MET由MET原癌基因编码，是一类具有自主磷酸化活性的跨膜受体，属于酪氨酸激酶受体超家族，肝细胞生长因子(HGF)是目前发现其唯一配体。当c-MET与HGF结合后，酪氨酸残基可出现自身磷酸化，酪氨酸激酶被激活，c-MET梭基末端酪氨酸发生磷酸化，激活下游RAS-MAPK /ERK、PI3K-PKB /AKT等信号通路，参与诱导多种上皮细胞有丝分裂、增加细胞存活时间、增强细胞迁移及向胞外基质侵袭能力、促进腺管状形态发生，在胚胎发育、上皮生长、组织分化、损伤修复等过程中发挥重要的调控作用[10，11]。c-MET参与调控多个生物学功能，包括增殖和侵袭，当失调的c-MET异常激活，可以导致肿瘤的生长和转移。许多恶性肿瘤都伴有c-MET基因的扩增和过度表达[12]。c-MET基因突变、扩增、c-MET蛋白过表达在NSCLC的发生发展及EGFR-TKI耐药性方面发挥重要作[13]。研究[14]发现，具有EGFR19外显子缺失突变的HCC827 细胞株对吉非替尼敏感，但长时间吉非替尼诱导后，HCC827细胞对吉非替尼产生耐药，检测c-MET 基因拷贝数发现其扩增5～10倍；进一步研究证明 c-MET 的基因扩增激活了c-MET/ ERBB3/PI3K信号通路，从而引起非小细胞肺癌对吉非替尼耐药。Noonan等[15]通过荧光原位杂交技术检测了447例NSCLC患者的肿瘤组织中EGFR、c-MET基因表达情况后发现，435例进行c-MET基因检测的患者中48例出现基因拷贝增高(≥5拷贝/细胞)，其中18例为真性c-MET基因扩增，c-MET基因扩增阳性患者较阴性患者生存期短，差异具有统计学意义，c-MET基因扩增是术后NSCLC患者的独立不良预后因素。c-MET 扩增作为除EGFR突变之外的另一种NSCLC 驱动基因，是体现不良预后的因子，同时也是EGFR-TKI 治疗继发耐药基因之一。研究[16]报道，在c-MET扩增的耐药肺癌细胞中，c-MET抑制剂可明显提高EGFR TKI耐药肺癌细胞的敏感性。

本研究结果发现，血清c-MET基因相对表达量与NSCLC性别、年龄、吸烟史、病理类型等临床病理特点均无关。生存分析显示，治疗前血清c-MET基因相对表达量情况与EGFR基因敏感突变晚期NSCLC患者EGFR-TKI治疗后PFS有关，但与OS无关。进一步分析发现，血清c-MET基因表达是晚期NSCLC EGFR-TKI治疗的独立不良预后因素。并说明血清c-MET参与了EGFR-TKI的获得性耐药，检测EGFR基因敏感突变晚期NSCLC患者EGFR-TKI治疗前血清c-MET基因的扩增情况可预测EGFR-TKI疗效。

综上所述, EGFR基因敏感突变的晚期NSCLC患者治疗前血清c-MET基因表达水平与吉非替尼治疗后PFS有关。血清c-MET基因表达可能成为EGFR基因敏感突变晚期NSCLC患者EGFR-TKI治疗疗效的预测因素。