化痰通络汤预先灌胃的合并高脂血症脑缺血大鼠神经系统功能、脑组织病理变化观察

张振强 ，贾亚泉，王自闯，郭艺青，张金燕，李芹，宋军营

(1河南中医药大学科研实验中心，郑州450046；2 河南中医药大学第二临床医学院)

高脂血症是一种全身性脂代谢紊乱性疾病，也是缺血性脑血管病的主要危险因素。高血脂引起内皮细胞损伤和血管舒张功能障碍，血管内皮功能障碍能够引起一氧化氮(NO)、血管内皮素-1(ET-1)、前列环素(PGI2)、血浆血栓素(TXB2 )等血管调节因子的变化，进而引起动脉粥硬化和缺血性脑损伤[1，2]。缺血性脑损伤后血管新生主要是血管内皮细胞的增殖、迁移、分化、细胞外基质降解、管腔形成和毛细血管生成等[1]。NO、ET-1可共同维持血管张力，反映血管内皮功能。血管内皮生长因子(VEGF)是一种具有神经营养和神经保护作用的血管生成蛋白，CD34 是最敏感的新生血管内皮标记物[3，4]。有研究[3]表明，在高脂血症状态下血管内皮功能受损时血液VEGF 水平下降，且对缺血后脑组织仍有毒性作用。VEGF能够通过刺激NO的作用显著地增强血管的舒张，促进受损内皮功能的修复[4]。我们前期实验研究发现高脂血症合并脑缺血患者血浆中vWFET-1、NO的表达水平低于单纯脑缺血、高血脂患者。化痰通络汤由法半夏、橘红、枳实、黄芪、丹参、山楂、川芎、鸡血藤等中药材配制而成，具有益气活血，化瘀通络之功效，对脑血管疾病具有一定的保护作用。目前关于化痰通络汤对高脂血症合并脑缺血动物模型中的治疗作用相关报道罕见。2016年12月～2017年2月，我们观察了化痰通络汤预处理对高脂血症合并脑缺血模型大鼠的治疗作用，并探讨其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂与仪器 SPF级SD大鼠70只，雄性，体质量(220±10)g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，质量合格证号：37009200004690。化痰通络汤加减[5](组成：法半夏12 g、橘红10 g、枳实10 g、黄芪30 g、丹参25 g、山楂20 g、川芎12 g、鸡血藤 18 g，以上八味水煎后，浓缩至相当于原生药材1.33 g /mL，备用)；柠檬酸(批号：20090306)和柠檬酸钠(批号：20070403)均购自北京化学试剂公司。兔抗鼠VEGF和CD34单克隆抗体购于武汉博士德生物工程有限公司。试剂盒NO、ET-1和VWF试剂盒购于南京建成生物工程有限公司。酶标仪(Thermo，型号1510)；洗板机(Thermo，型号：888)；显微镜(OLYMPUS，BX61)；切片机(LEICA，2245)；电子天平(上海精密科学仪器有限公司，型号FA/JA-B)；动物血尿生化分析系统(IDEXX，Procyte DX)。

1.2 高脂血症合并脑缺血模型制备与化痰通络汤给予方法 大鼠适应性饲养3天后，断尾取血检测血脂四项值，每天给予高脂饲料(组成：3.5%胆固醇、10%猪油、0.2%丙硫氧嘧啶、0.5%胆酸钠、5%白糖、80.8%基础饲料)喂养，共喂养6周。分别于高脂饲养前、饲养6周时断尾取血，检测大鼠血清总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白升高，高密度脂蛋白降低(P均<0.05)，则说明高脂血症模型制备成功。将高脂血症模型大鼠随机分为高脂血症对照组(正常组)15只、高脂血症假手术组(假手术组)15只、高脂血症合并脑缺血组模型组(模型组)20只、治疗组20只，按预实验死亡率25% 计，保证造模成功后取材的动物数共70只。饲养第7周开始，治疗组予化痰通络方1.330 g/(kg·d)灌胃处理，正常组、假手术组和模型组予等体积生理盐水，连续4周，每天1次。饲养第9周时，模型组和治疗组根据Longa[6]报道的线栓法建制备脑缺血模型： 10% 水合氯醛溶液腹腔注射麻醉大鼠，颈部正中切口钝性分离皮下组织，暴露暴露左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)。结扎ECA、CCA，并穿线于ICA，用中号动脉夹夹闭ICA。用眼科剪将CCA剪一小切口，由此迅速插入线栓，轻推线栓使之由颈总动脉通过分叉部进入颈内动脉，至大脑中动脉的起点，插入深度约18～22 mm，使其阻断大脑中动脉的血液供应。手术过程中用白炽灯加热维持动物体温。假手术组手术过程与模型组相同，分离出左侧的CCA、ECA、ICA，不结扎血管，不插入线栓。正常组大鼠不做任何处理。

1.3 各组大鼠 神经系统功能及脑梗死体积测算 饲养11周时，5分制评分方法[6]评定模型组、治疗组大鼠神经系统功能。0分：无体征；1分：动物右侧下肢不能完全伸展；2分：右下肢瘫痪，出现追尾现象；3分：肢体瘫痪，不能站立；4分：动物昏迷，无自主性活动。评级越高，大鼠的行为障碍越严重。10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速断头取脑组织，去掉小脑，-20 ℃冰箱冷冻20 min。取出脑组织第一刀切在脑前极与视交叉连线中点处，第二刀切在坏死区呈白色，未坏死区颜色呈淡红色视交叉部位，第三刀切在漏斗柄部位，第四刀切在漏斗柄与后叶尾极之间，将脑组织切成5～6片，将切片置于1%四氮唑红中，锡箔纸盖住37 ℃避光染色10～30 min，4%多聚甲醛中固定，拍照观察并测算脑组织坏死区面积，计算脑梗死体积比。脑梗死体积比=梗死体积/全脑体积×100%。

1.4 各组脑组织NO、ET-1和vWF检测 采用ELISA法。饲养11周时，取各组大鼠，腹腔注射麻醉，断头取脑，去除嗅脑、脑干、小脑，用预冷的生理盐水洗去表面残血，用滤纸吸干表面残液，称重，用事先预冷的生理盐水按质量与体积比为1∶9的比例，冰浴下制备成10%的脑组织匀浆液，4 000 r/min离心15 min，取上清液，-20 ℃冰箱保存，依照试剂盒说明书步骤，ELISA法检测脑组织中NO、ET-1和vWF的含量。重复3次，取平均值。

1.5 各组大鼠脑组织VEGF、CD34检测 采用免疫组化法。饲养11周时，取各组大鼠，麻醉后剪开胸腔，充分暴露心脏。首先在右心耳剪一小口，从左心室先灌注生理盐水，待大鼠前肢和两肺变白，流出液澄清无血色，改用4%的多聚甲醛灌注固定。断头取出全脑，除去小脑，4% 的多聚甲醛固定保存，石蜡包埋切片。常规脱蜡脱水；用3 % H2O2室温下7 min灭活内源性酶，蒸馏水洗3次；热修复抗原，PBS洗2次；滴加5% BSA封闭液，室温20 min；分别滴加相应稀释的一抗(VEGF和CD34均为1∶400)，4 ℃过夜，PBS洗3次；滴加二抗37 ℃孵育20 min，PBS洗3次；滴加SABC，37 ℃孵育20 min，PBS洗4次；DAB显色，反应7 min左右，蒸馏水清洗；苏木素复染，1 %的盐酸酒精分化1 s，脱水，透明，封片。显微镜下观察拍照，采用Image-Pro-Plus 7.0图像分析系统测其平均光密度值。以平均光密度值代表VEGF、CD34的阳性表达量。重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 治疗组、模型组大鼠神经功能评分及脑梗死体积比比较 治疗组与模型组大鼠神经功能评分分别为(1.63±0.20)、(3.11±0.22)分，二者比较，P<0.05。治疗组与模型组大鼠脑梗死体积比分别为16.82%±7.18%、32.97%±9.86%，二者比较，P<0.05。

2.2 各组大鼠脑组织NO、ET-1、vWF含量比较 各组大鼠脑组织NO、ET-1、vWF含量比较见表1。

表1 各组大鼠脑组织NO、ET-1、vWF含量比较

注：与正常组、假手术组比较，aP<0.05;与模型组比较,bP<0.05。

2.3 各组大鼠脑组织VEGF、CD34阳性表达量比较 各组大鼠脑组织VEGF、CD34阳性表达量比较见表2。

表2 各组大鼠脑组织VEGF、CD34阳性表达量比较

注：与正常组、假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

3 讨论

中医认为，高脂血症合并脑缺血的核心病机为痰瘀阻络，痰浊和瘀血同时又是脏腑功能失调、气血津液代谢失常的病理产物，治以化痰祛瘀通络，即“痰化癖去，脑络畅达，气血流通，疾病方能向愈”。化痰通络方药由法半夏、橘红、枳实、黄芪、丹参、山楂、川芎、鸡血藤八味药组成。半夏化痰，鸡血藤活血通络；川芎血中气药，丹参味凉血活血，二药合用具有行气活血祛瘀之作用；橘红理气化痰，枳壳行气解郁，黄芪健脾益气，山楂活血消食，食积亦为痰瘀之源，诸药合用可谓标本同治。

近年来，中药治疗对脑缺血后的血管新生影响的研究也渐成为研究热点。缺血区微血管的新生对于脑卒中的治疗和神经功能恢复至关重要，脑缺血后血管新生机制复杂，由多种促血管生长因子参与。VEGF是主要的调控因子，能够作用于血管内皮细胞的特异性多功能因子，诱导内皮细胞增殖以及毛细血管瓣的生成，从而促进新生血管的生成，VEGF还通过诱导内皮细胞内的抗凋亡蛋白表达维持新生血管中内皮细胞的生存[7～10]。CD34是血管内皮细胞标志物，可作为检测微血管密度的首选标志物[11，12]。新形成的侧枝血管可改善缺血区周围的组织灌流及脑缺血后的神经功能恢复[13]。本研究结果显示，模型组脑组织VEGF、CD34表达增加，化痰通络方药作用后VEGF和CD34的表达增加更显著，而且神经功能评分降低，缺血面积减少。这表明化痰通络方药能够预防性治疗高脂血症合并脑缺血引起的大鼠脑组织损伤，并通过对血管调节因子VEGF和CD34表达的上调发挥作用，修复高脂血症条件下的缺血组织边缘区血管内皮功能。也有研究[14～16]表明，VEGF表达的增加能够VEGF减少脑梗死面积、减轻脑水肿、促进受损内皮功能的修复的作用，说明血管调节因子在高脂血症条件下的缺血不同时期既有累积现象又有特异性的表达，可能有助于脑缺血恢复期损伤的修复[1]。

本研究结果还显示，治疗组脑组织NO含量显著增加，ET-1和vWF含量显著降低，提示化痰通络方药在修复高脂血症条件下的缺血脑组织的血管内皮功能障碍方面具有重要作用。vWF是关键的参与缺血性脑中风的因素，当脑组织发生缺血时，vWF表达明显增加。也有研究[1]发现，ET-1/ NO表达量下降，可能有利于脑缺血损伤的恢复。NO 是许多血管生长因子的下游介质，所以能够与VEGF相互协调共同作用促进血管新生[17]，但这个机制还需要进一步的研究证实。

综上所述，化痰通络汤预先灌胃的合并高脂血症脑缺血大鼠的神经系统功能、脑梗死体积均减少，其机制可能为促进脑组织NO、VEGF、CD34表达，降低ET-1和vWF含量。