小鼠髓样细胞触发受体-2基因小发卡状RNA慢病毒载体构建

冉江霞，石胜良，王成志

(1 广西医科大学第二附属医院，南宁 530007；2 广西医科大学第三附属医院)

阿尔茨海默病(AD)是最常见的老年变性疾病，迟发型阿尔茨海默病(LOAD)是其重要分型。LOAD的发病核心与基础是细胞外β-淀粉样蛋白(Aβ)异常集聚以及由其引发的神经细胞毒性作用。针对Aβ的免疫性治疗清除中枢神经系统的Aβ一直被认为是治疗AD的关键，但严重的不良反应导致治疗效果不佳[1]。髓样细胞触发受体(TREM2)是免疫球蛋白超家族中的一个受体家族。研究[2，3]认为，髓样细胞触发受体-2(TREM2)在介导小胶质细胞Aβ吞噬和调节中枢神经炎症中有重要作用，与LOAD的发生发展有关。但其具体作用机制尚不明确。AD患者脑组织TREM2基因高表达[4]，尤其是Aβ斑块周围的小胶质细胞[2,5，6]，并与脑组织Aβ含量呈正相关[7，8]。因此，阐明TREM2的具体作用机制可能为AD的预防和治疗提供新靶点。2017年12月～2018年5月，我们构建了TREM2基因小发卡状RNA(shRNA)慢病毒表达载体(TREM2-shRNA)，并检测其对小鼠BV2小胶质细胞TREM2基因的沉默效果，旨在为后续细胞水平研究TREM2在LOAD发生发展中的作用机制机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 小鼠BV2小胶质细胞由首都医科大学宣武医院馈赠。大肠埃希菌菌株DH5α、293T细胞、慢病毒载体GV248、pHelper 1.0载体、pHelper 2.0载体、Age I及dsDNA oligo购于上海吉凯基因化学技术有限公司；Primer购于捷瑞生物公司；胎牛血清、DMEM高糖培养基和Opti-MEM购于Gibco公司；Plasmid抽提试剂盒购于天根生化公司；EcoR Ⅰ和T4 DNA连接酶购于Thermo Scientific公司；Taq聚合酶购于Vazyme公司；RNA抽提试剂TRIzol购于Invitrogen公司；cDNA逆转录试剂盒和PCR试剂盒购于TAKARA公司。

1.2 TREM2-shRNA的构建、鉴定

1.2.1 TREM2-shRNA的构建 针对GenBank中小鼠TREM2基因的mRNA序列(NM_031254)设计3个RNA干扰( RNAi)靶点序列，分别为①5′-TTGCTGGAACCGTCACCAT-3′；②5′-AGAGGCTGAGGTCCTGCAGAA-3′；③5′-AGCGGAATGGGAGCACAGTCA-3′。同时设计阴性对照插入序列：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。根据靶点序列设计相应的编码shRNA发夹结构的DNA模板链及其互补序列(表1)，由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。将以上互补链经退火形成双链DNA，与经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后的线性化GV248载体连接。反应体系如下：100 ng/μL线性化载体1 μL，100 ng/μL双链DNA 1 μL，T4 DNA连接酶1 μL，10×T4 DNA连接酶缓冲液2 μL，加ddH2O至20 μL，16 ℃连接过夜。将连接产物转化感受态大肠埃希菌DH5α，取适量菌液接种至LB固体培养基平板上，孵育过夜。挑取阳性重组克隆TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3送上海美季生物技术有限公司进行DNA测序。测序结果显示，合成的TREM2 shRNA1、shRNA2、shRNA3寡核苷酸序列均已成功插入载体中，无突变且位置正确，与预先设计完全一致。

表1 TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3的引物序列

1.2.2 TREM2-shRNA的包装及滴度测定 分别将TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-320 μg、包装质粒pHelper 1.0载体15 μg、pHelper 2.0载体10 μg与相应体积的吉凯转染试剂混匀使其总体积为1 mL，共转染密度为70%～80%的293T细胞。培养6 h换成完全培养基，培养24 h荧光显微镜下观察绿色荧光(GFP)情况，培养48 h收获细胞上清，对其进行超速离心沉淀得到高滴度的慢病毒浓缩液，-80 ℃保存备用。滴度测定前1天，将处于对数生长期的293T细胞以约4×104/孔接种于96孔板中；用培养基以10倍梯度逐孔稀释病毒原液为6个浓度(100～10-5)，用不同浓度的病毒液感染293T细胞，培养24 h更换为完全培养基。继续培养4 d，荧光显微镜下观察GFP情况，测算病毒滴度。病毒滴度(TU/mL)=荧光细胞数/病毒原液量。

1.3 TREM2-shRNA对BV2小胶质细胞TREM2表达的影响观察

1.3.1 BV2小胶质细胞分组及 TREM2-shRNA感染 取对数生长期BV2小胶质细胞，5×104/孔接种于24孔板中培养。培养24 h待细胞密度约70%时，将细胞分为TREM2-shRNA-1感染组、TREM2-shRNA-2感染组、TREM2-shRNA-3感染组、阴性对照组及空白对照组5组，每组6个复孔，TREM2-shRNA-1感染组、TREM2-shRNA-2感染组、TREM2-shRNA-3感染组、阴性对照组分别感染TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3、shRNA空质粒，以感染复数=80感染细胞，培养6 h后更换为完全培养基，空白组不做任何处理。TREM2-shRNA-1感染组、TREM2-shRNA-2感染组、TREM2-shRNA-3感染组感染120 h在荧光显微镜下均观察到GFP，且感染效率均达95%以上，提示慢病毒感染成功。

1.3.2 各组细胞TREM2 mRNA检测 感染120 h取各组细胞，裂解提取总RNA，合成cDNA，Q-PCR法检测各组TREM2 mRNA。TREM2上游引物：5′-AGCCTACCACCTTCCTCCTCT-3′，下游引物：5′-TCACGTACCTCCGGGTCCAGT-3′。β-actin上游引物为：5′-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3′，下游引物：5′-ATGTCACGCACGATTTCCC-3′。反应体系，上游引物(0.7 μmol/L)0.7 μL，下游引物(0.7 μmol/L)0.7 μL，cDNA 1.0 μL，2x SYBR Green Mix 5 μL，ROX 0.5 μL，加RNase-free water至10 μL。反应条件95 ℃ 预变性2 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。采以2-△△Ct代表TREM2 mRNA的相对表达量。计算细胞沉默效率，沉默效率=(1-重组慢病毒载体组TREM2 mRNA相对表达量/空白对照组TREM2 mRNA相对表达量)×100%。每组设3个复孔，实验重复3次，取平均值。

2 结果

TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3转染293T细胞24 h荧光显微镜下均可观察GFP，证实病毒包装成功。经计算，TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2和TREM2-shRNA-3的滴度分别为(4×108)、(4×108)、(5×108)TU/mL。TREM2-shRNA-1感染组、TREM2-shRNA-2感染组、TREM2-shRNA-3感染组、阴性对照组及空白对照组TREM2 mRNA相对表达量分别为49.4%±3.98%、79.7%±2.01、65.3%±2.41%和39.2%±6.98%，与空白对照组和阴性对照组比较，TREM2-shRNA-1感染组、TREM2-shRNA-2感染组、TREM2-shRNA-3感染组TRME2 mRNA相对表达量均降低(P均<0.05)；与REM2-shRNA-1感染组、T、TREM2-shRNA-3感染组比较，REM2-shRNA-2感染组TRME2 mRNA相对表达量降低(P均<0.05)。TREM2-shRNA-1感染组、TREM2-shRNA-2感染组、TREM2-shRNA-3感染组、阴性对照组的沉默效率分别为49.4%±3.98%、79.7%±2.01、65.3%±2.41%和39.2%±6.98%，TREM2-shRNA-2感染组沉默效率最高。

3 讨论

TREM2基因位于小鼠染色体17C3上，包括5个外显子结构，编码一个跨膜糖蛋白受体，属于免疫球蛋白-凝集素样超家族受体的成员。它由胞外免疫球蛋白样结构域、跨膜结构域和胞质尾部组成。酪氨酸激酶结合蛋白常与TREM2的跨膜区域相互作用并且通过其胞质免疫受体酪氨酸激活基序来招募蛋白酪氨酸激酶(Syk)。Syk启动比如Ca2+动员、蛋白质酪氨酸磷酸化和细胞外信号调节激酶激活等一系列信号事件[9]，这些信号促进细胞存活、增殖、吞噬和炎症调节。TREM2广泛分布于脑内，以白质、海马和新皮质最多，并主要表达于髓样细胞如小胶质细胞、巨噬细胞和树突状细胞[10]。在中枢神经系统中，TREM2仅存在于小胶质细胞上[11]。因此，通过沉默TREM2在小胶质细胞中的表达，来研究TREM2是通过何种通路调控小胶质细胞对Aβ的吞噬并抑制中枢炎症反应是非常有必要的，对于探索TREM2基因在LOAD中的作用机制十分重要。

研究目的基因在相关疾病发生发展中是否发挥重要作用及其相关分子机制通常需要观察细胞中目的基因沉默后其下游基因蛋白表达变化和细胞生物学行为变化，RNAi正扮演着这样一个重要角色。RNAi是利用双链RNA与靶基因mRNA特异性结合，引起同源基因特异性降解的一种转录后基因沉默现象。常被用于RNA干扰的是shRNA，它是一段具有紧密发卡环的RNA序列。RNAi技术作为新兴的基因阻断技术在基因功能和相关方面的研究具有许多传统反义技术无法比拟的优势：高度特异性、高效性、高稳定性、快速性、可遗传性和可传播性等[12]。目前，RNAi已成为研究功能基因组学、基因治疗、信号传导通路分析和药物靶点筛选等热门领域的强有力工具。

RNAi的有效性主要由基因转移的效率决定。目前，基因转移技术有多种，常用的有质粒和病毒载体。质粒作为载体介导RNAi转染时，存在转染效率低、对基因的抑制表达作用弱、作用持续时间短、无法转染非分裂相细胞等缺点，因而，在实际应用中受到限制。病毒载体中，慢病毒载体近几年来受到了科研工作者们的青睐。慢病毒载体是一种复制缺陷型逆转录病毒载体，是在HIV-Ⅰ基础上改造成的病毒载体系统。慢病毒载体充分发挥了自身所具备的优势，比如病毒效价高、生物安全性高、感染谱广、感染效率高、容纳目的基因片段大、目的基因表达持久稳定和免疫反应小等[13～15]。这些优势使慢病毒载体成为RNAi的首选载体[16]。因此，本实验采取GV248慢病毒载体，该载体中含有U6启动子，在宿主细胞中能持续表达有干扰作用的shRNA；该载体还含有IRES和Ubiquitin启动子，且它们后面分别紧接puromycin和EGFP，这使得该载体感染目的细胞后，puromycin和EGFP能更高效地表达，有利于后续使用嘌呤霉素对细胞进行筛选和对感染效率进行观察。本研究构建了TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3等3种小鼠TREM2基因shRNA慢病毒表达载体，并均通过测序鉴定，经包装产生慢病毒的滴度达到后续实验要求。由于病毒对小鼠BV2小胶质细胞的感染效率显著高于siRNA和质粒的转染效率，因此，本研究使用包装后的慢病毒感染小鼠BV2小胶质细胞进行有效靶点的筛选。3种小鼠TREM2基因shRNA慢病毒表达载体感染小鼠BV2小胶质细胞后，荧光显微镜下观察，感染效率可达95%以上；TREM2 mRNA相对表达量均下降，筛选出沉默效果最佳的TREM2-shRNA-2，对TREM2基因mRNA表达的沉默效率可达79.7%。

综上所述，成功构建TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3。TREM2-shRNA-1、TREM2-shRNA-2、TREM2-shRNA-3均可沉默小鼠BV2小胶质细胞中TREM2基因表达，以TREM2-shRNA-2沉默效果最好。