急性脑梗死患者血清循环miR-424表达变化及其与炎症反应、脂代谢的关系

郜乐乐，常永超，程丽妞，申绯翡，刘洪利

(1洛阳职业技术学院医学系，河南洛阳471000；2河南科技大学第一附属医院；3洛阳职业技术学院药学与检验系)

急性脑梗死(ACI)约占脑梗死的70%。早期诊断、及时采取有效的治疗策略是影响ACI患者预后的关键[1]。原位血栓或其他部位血栓脱落导致脑栓塞是诱发ACI的主要原因。炎症反应、脂代谢在ACI的发生、发展中起重要作用[2, 3]。白细胞介素6(IL-6)、IL-8、C反应蛋白(CRP)是临床常用的炎症因子指标。寻找能够反映ACI病理改变的血清生物靶标，对于ACI的早期诊断、指导治疗和预后判断，均具有积极意义。微小RNA(microRNAs)是小非编码RNA，长度18～25 nt，参与调节多种生理病理过程。ACI患者血清中存在多种异常表达的microRNAs[4, 5]。microRNA-424(miR-424)对ACI导致的脑组织缺血性损伤具有保护作用[6]。但目前关于血清循环miR-424在ACI早期诊断、预后判断中的作用相关报道罕见。我们检测了100例ACI患者血清循环miR-424，分析其与炎症反应、脂代谢及患者预后的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2012年1月至～2017年3月间河南科技大学第一附属医院收治的100例ACI患者其中男62例、女38例，年龄59～78(68.21±6.35)岁，根据世界卫生组织(WHO)规定的ACI相关诊断标准[7]，制定纳入标准：初次发作的脑梗死患者；发病72 h内入院；影像学检查确诊为ACI。排除标准：合并乙肝等传染性疾病者；合并肝肾等重要器官功能不全者；具有心肌梗死、周围血管性病变等病史者。100例患者根据NIHSS评分分为重度ACI患者61例和轻度ACI患者39例。选取同期我院门诊体检的60例健康者，其中男38例、女性22例，年龄60～78(67.58±6.66)岁。所有纳入者年龄、性别比例等一般资料具有可比性。所有研究对象均签署知情同意书，本研究获河南科技大学第一附属医院伦理委员会审核同意。

1.2 血清循环miR-424检测 抽取纳入者晨起空腹静脉血10 mL，室温静置10 min，3 000 rpm离心20 min，取上清，-80 ℃保存备用。实时定量PCR法检测血清循环miR-424：TRIzol试剂提取血清总RNA，采用Hairpin-itTM miRNAs qPCR定量试剂盒，ABI7500实时定量PCR系统，进行反应。反应条件如下，95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s，共40个循环。引物序列如下，miR-424正向引物：5′-GGCTAGTCAGCAGCAATTCATGT-3′，miR-424反向引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6反向引物：5′-AACGCTTCA CGAATTTGCGT-3′，以U6为内参，以2-ΔΔCt代表血清循环miR-424的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.3 血清炎症反应因子检测 采用ELISA法检测检测血清 IL-6、IL-8、CRP，所有操作均严格参照试剂盒(北京方程嘉鸿科技有限公司)的操作步骤，采用全自动酶标仪(DNM-9602G)检测。实验重复3次，取平均值。

1.4 血清脂代谢指标检测 酶法检测纳入者血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)水平，直接法检测低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)以及高密度脂蛋白(HDL-C)水平，采用全自动生化仪(日立7080)进行检测。

1.5 ACI患者随访方法 采用门诊、电子通讯等方式，对ACI患者进行为期1年的随访，采用格拉斯哥预后评分(GOS)评估ACI患者预后情况，GOS评分越高表示病情好转，分数越低表示病情越重[8]。

2 结果

轻、 重度ACI患者及健康者血清循环miR-424相对表达量分别为0.71±0.21、0.62±0.24、0.98±0.36，与健康者比较，轻、 重度ACI患者血清循环miR-424相对表达量均降低(P均<0.05)；与轻度ACI患者比较，重度ACI患者血清循环miR-424相对表达量降低(P<0.05)。

轻、 重度ACI患者及健康者血清IL-6、IL-8、CRP水平比较见表1。

轻、 重度ACI患者及健康者血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比较见表2。

轻度、 重度ACI患者GOS评分分别为(3.15±0.65)、(2.14±0.59)分，二者比较，P<0.05。相关性检验结果显示，ACI患者血清循环miR-424水平与HDL-C、GOS评分呈正相关(r=0.49、0.61;P均<0.05)，与血清IL-6、IL-8、CRP、TC、TG、LDL-C水平均呈负相关(r=-0.36、-0.42、-0.39、-0.47、-0.56、-0.57;P均<0.05)。

表1 轻、 重度ACI患者及健康者血清IL-6、IL-8、CRP水平比较

注：与健康者比较，*P<0.05；与轻度ACI患者比较，#P<0.05。

表2 轻、重度ACI患者及健康者血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比较

注：与健康者比较，*P<0.05。

3 讨论

ACI是最常见的脑部疾病之一，病情复杂、预后差、致残率高。近年ACI发病率逐年增加。ACI早期症状不明显(如头晕、呕吐、头痛等)，但病情发展迅速，可导致患者昏迷、半身不遂甚至死亡。寻找有效的ACI早期诊断、预后判断的血清生物靶标有助于提高治疗疗效、改善患者预后。目前已发现多种与ACI关系紧密的血清分子，如ACI患者脑脊液中血清胱抑素C(cystatin C)可进入血循环，导致血清cystatin C水平升[9]；高尿酸血症是心血管疾病的独立危险因素，Han等[10]的回顾性研究结果证实，血尿酸与ACI患者的脑白质高信号有关[10]；此外，血清牙龈卟啉单胞菌特异性IgG是我国居民患ACI的危险因素[11]。

血清循环microRNAs能够耐受RNA酶进而稳定存在于血循环，可作为疾病的诊断指标。Miyaaki等[12]研究发现，血清microRNA-122可作为非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)诊断的生物学标志分子。血清microRNA-218可作为食管癌患者早期诊断的生物标记物和雨后预测的靶分子[13]。卵巢癌患者血清microRNA-145[14]、乳腺癌患者血清microRNA-21[15]以及结肠癌患者血清microRNA-155[16]在诊断、预测病情进展及患者预后等方面均具有积极意义。血清miR-16可作为超急性脑梗死的诊断、危险评估及预后的生物靶标[17]；血清miR-24、miR-21可作为ACI患者早期诊断的生物靶标[4]；血清miR-124可作为脑梗死早期诊断的生物靶标[18]。

miR-424低表达与卵巢癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和结肠癌的增殖、侵袭以及耐药性均关系紧密[19～21]。miR-424在血管性疾病(如肺动脉高血压)、中枢神经系统疾病(如脆性X相关的震颤/共济失调综合征)和不同组织干细胞分化中均发挥重要作用[22]。有研究[23]证实，小鼠脑缺血4 h后血清miR-424表达明显降低，增加miR-424表达可减轻脑梗死体积和脑水肿。本研究发现，与健康者相比，ACI患者血清循环miR-424水平降低。说明miR-424减少可能参与并促进了ACI发生、进展。

高脂血症、高血压、炎症反应、吸烟、酗酒等都是诱发ACI的重要危险因素。炎症反应是导致ACI继发性脑损伤的关键因素之一，Liu等[24]研究发现，ACI患者的血清IL-33水平显著升高，可能参与并促进了ACI发生进展过程。本研究发现，ACI患者血清IL-6、IL-8、CRP水平均升高，提示炎症反应因子参与了ACI发生、进展。近年来，越来越多的证据表明，炎症在脑梗死发生和复发中发挥作用，如脑梗死患者血清中TNF-α、IL-1以及IL-6存在异常表达，炎症反应强度可反映ACI病情严重程度，血清炎性因子是一系列对机体炎症反应具有促进作用的细胞因子，在一定程度上可反应机体的应激状态。

脂代谢紊乱与ACI关系密切，血脂升高可引起血液黏度升高，红细胞携氧和释氧功能下降，导致局部组织缺血缺氧，易引发脑梗死。ACI患者普遍存在血脂代谢异常，多表现为TG、TC、LDL明显升高，而HDL明显降低[25]，本研究结果显示，ACI患者血清TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，证实ACI患者体内存在脂代谢异常。

本研究进一步分析了血清循环miR-424与炎症反应因子、脂代谢指标及GOS评分的相关性，结果显示，ACI患者血清循环miR-424水平与血清IL-6、IL-8、CRP、TC、TG、LDL-C水平均呈负相关，与HDL-C呈正相关，提示ACI患者血清循环miR-424水平可反映患者炎症反应、脂代谢的波动程度。尽管IL-6、IL-8、CRP、TC、TG、LDL-C、HDL-C均不是miR-424的直接靶基因，但各指标与miR-424均呈负相关性，由此推测，miR-424低表达可增加某些关键信号通路分子的表达，进而导致炎症反应增强、脂代谢紊乱。miR-424是血管生成的重要调节因子，Lee等[26]发现miR-424参与炎症介导的血管再生，后续研究将在体外细胞水平探究miR-424参与炎症反应、脂代谢的分子机制。此外，本研究发现血清循环miR-424与ACI患者GOS评分呈正相关，GOS评分可反应患者功能预后情况，以上结果均提示，监测ACI患者血清循环miR-424水平，对病情评估、预后判断有较高的临床价值。

综上所述，ACI患者血清循环miR-424表达下降，血清循环miR-424水平与ACI患者炎症反应因子水平、脂代谢水平有关miR-424可能成为ACI患者预后评估的一种潜在的生物靶标。