基质金属蛋白酶及其抑制剂在糖尿病皮肤创面愈合中作用的研究进展

冯洁，农晓琳

(广西医科大学口腔医学院 广西医科大学附属口腔医院，南宁530021)

皮肤创面愈合功能受损是糖尿病并发症之一，15%～25%的糖尿病患者会发生糖尿病足溃疡(DFU)，长期不愈合者有高度截肢甚至死亡风险[1]。正常皮肤创面愈合是一个复杂且涉及高度精细事件的过程，包括止血、炎症反应、增殖、肉芽组织形成、再上皮化、血管生成以及基质重塑。该过程中形成细胞外基质，促进伤口中细胞黏附、迁移和组织重塑等过程。创面愈合过程需要降解细胞外基质来控制，因此细胞外基质形成与降解过程之间的不平衡可能导致慢性溃疡不愈。基质金属蛋白酶(MMPs)属于Zn2+依赖金属蛋白酶超家族，能降解细胞外基质成分，参与创面愈合，炎症期消除损伤的蛋白质和暂时性细胞外基质，在血管生成和细胞迁移的增殖期分解毛细血管基底膜，重塑期时能收缩和重塑组织；参与创面愈合中与免疫相关的控制过程、细胞迁移、血管生成，并通过作用于各种细胞外效应蛋白发挥作用，包括细胞因子、趋化因子、抗微生物肽、各种细胞表面蛋白质、甚至一些细胞外基质成分[2]。基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)是MMPs的特异性抑制物，通过调节MMPs水平来调节其活性，能够结合并可逆性阻断MMPs活性。糖尿病皮肤创面难以愈合与MMPs和TIMPs的不平衡有关[3，4]。现将MMPs与TIMPs在糖尿病皮肤创面愈合过程中的作用综述如下。

1 MMPs与TIMPs的分类

MMPs根据其底物特异性和细胞定位，可分为以下类型：①胶原酶：MMP-1、MMP-8、MMP-13及MMP-18；②明胶酶：MMP-2和MMP-9，催化域内有纤连蛋白Ⅱ型基序，使其能够结合并降解明胶、胶原等；③间充质溶解素类：MMP-3、MMP-10和MMP-11；④MT-MMPs：MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-24和MMP-25；⑤基质溶解素类：MMP-7、MMP-26，均没有与血红素结合蛋白序列；⑥其他：MMP-11、MMP-12、MMP-19、MMP-20、MMP-21、MMP23A、MMP23B、MMP-27和MMP-28。TIMPs目前有四种亚型，TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4。

2 MMPs在糖尿病皮肤创面愈合中的作用

2.1 胶原酶 在各种细胞培养和体外皮肤模型中，Ⅰ型胶原的角质形成细胞迁移依赖于MMP-1。研究发现，人体皮肤中的MMP-1切割Ⅰ型胶原，导致整合素α2β1亲和力减弱，减轻了细胞运动的限制从而促进再上皮化[3]。但MMP-1过度表达不利于再上皮化，仅在创面迁移性上皮边缘的基底角质形成细胞中表达，发生创伤会迅速增加，必须减少其过度表达以有利于再上皮化。Lobmann等[5]报道，相比于非糖尿病患者，DFU患者MMP-1高65倍，其机制可能是由于高蛋白水解环境导致糖尿病患者皮肤创面愈合不良。还有研究表明，与健康皮肤相比，1型糖尿病DFU角质形成细胞中MMP-1表达增加[6]。

MMP-8能有效切割Ⅰ型胶原，主要由中性粒细胞表达和储存。一旦发生炎症，中性粒细胞会渗透到组织中释放和活化MMP-8[7]。Gooyit等[8]合成MMP-8抑制剂化合物21选择性靶向抑制胶原酶MMP-8和MMP-12，结果显示，db/db糖尿病小鼠与对照组相比创面延迟愈合，再上皮化减少，细胞凋亡增加，表明MMP-8在糖尿病创面愈合过程中发挥有利的作用。MMP-8在正常创面愈合中具有关键作用，但蛋白质的过度表达可能引起胶原过度分解、中性粒细胞延长炎症期，从而导致创面延迟愈合。在慢性愈合创面中可检测到MMP-8活性和水平增加。研究发现，相比于非糖尿病患者，DFU患者MMP-8明显升高[6]。Chang[4]报道，在db/db糖尿病小鼠的创面中鉴定出活性MMP-8，与非糖尿病小鼠相比，db/db小鼠创面中活性MMP-8水平上调。

MMP-12能够降解Ⅰ型胶原。研究发现，MMP-12敲除小鼠的成纤维细胞形成减少，创面收缩减小，与对照组相比，成纤维细胞的增殖和转化生长因子β1诱导的肌成纤维细胞分化降低，表明MMP-13影响创面愈合中角质形成细胞的迁移、血管生成和收缩[9]。Ahmed等[10]建立糖尿病大鼠肌腱损伤模型，发现与糖尿病大鼠未受损肌腱相比，损伤肌腱中MMP-13表达增加，且愈合组织的血管细胞周围观察到MMP-13免疫反应性增加。Pincus等[11]建立雌激素缺乏的糖尿病创面模型，发现局部应用17β-雌二醇治疗后MMP-13活性降低，创面愈合加速。

2.2 明胶酶 MMP-9能影响角质形成细胞迁移和上皮再生，在糖尿病损伤组织中表达增高，大量研究表明，过量的MMP-9是糖尿病皮肤创面愈合不良的预测因素[4，6，12，13]。当机体发生感染时，伤口中的巨噬细胞分泌一些炎症调节剂作用于感染性刺激物，如IL-1β、TNF-α和IL-6，这些细胞因子均与MMP-9的活性有关[14]。Gooyit等[8]合成选择性MMP-9抑制剂，发现MMP-9抑制剂局部治疗db/db糖尿病小鼠创面，与对照相比愈合加速，再上皮化增多，细胞凋亡显著减少，证实MMP-9活性升高导致创面难以愈合，使用选择性MMP-9抑制剂有望干预治疗糖尿病皮肤创面愈合。Singh等[15]研究表明，MMP-9基因表达异常是难愈性糖尿病性溃疡的原因之一，与对照相比，糖尿病创面具有显著的非甲基化MMP-9基因启动子状态，这可能是MMPs表达受损的结果。Li等[1]发现，DFU患者受损皮肤中的MMP-9水平高于健康患者和糖尿病患者的健康皮肤，且MMP-9上调程度与定植细菌数呈正相关，认为MMP-9在糖尿病创面中的上调和活动可能是高葡萄糖和晚期糖基化终产物诱导。Guillemin等[16]使用壳聚糖及硫酸软骨素溶液加入Ⅰ型胶原制成的基质GBT013敷料作用于糖尿病小鼠慢性伤口模型，能够降低MMP-9酶活性，改善糖尿病创面愈合。Henshaw等[17]在DFU局部应用蜂胶6周，与对照组相比，蜂胶组溃疡面积减少，清创伤口处MMP-9降低，提示蜂胶能下调MMP-9，减少炎症，改善糖尿病创面愈合。

MMP-2在糖尿病损伤中高表达。研究发现，高血糖可增加血管细胞中MMP-2活性，刺激细胞外基质降解并在糖尿病中引起失衡[5]。Krisp等[13]使用多维蛋白鉴定技术研究慢性DFU渗出物，发现MMP-2增高，对降解胶原蛋白和组织破坏具有显著影响。Guillemin等[16]使用敷料GBT013作用于糖尿病小鼠慢性创面模型，发现其能够抑制体外MMP-2酶活性，防止生长因子降解，促进细胞增殖，从而促进糖尿病创面愈合。

2.3 间充质溶解素类 MMP-3参与组织重塑，可能降解胶原原纤维，并激活其他MMPs，如MMP-1、MMP-7和MMP-9。已有研究发现，与受伤健康大鼠相比，糖尿病大鼠受损肌腱中MMP-3基因表达下调，提示MMPs表达改变影响基质蛋白降解和组织重塑，指出MMPs调节治疗可能是糖尿病手术伤口新的再生愈合方法[10]。

MMP-10在体外可以降解弹性蛋白、非原纤维胶原蛋白、蛋白聚糖、明胶和酪蛋白，在创面边缘表达。研究发现，严格调节MMP-10表达水平是创面部位基质降解的先决条件，进而控制角质形成细胞迁移[18]。López-López等[6]体外观察到维生素D介导的DFU源角化细胞中MMP-10表达下调，认为MMP-10下调有助于糖尿病创面组织重建修复。

MMP-11常表达于皮肤创面愈合和基底细胞癌间质中。Hattori等[19]报道，松弛素能改善糖尿病小鼠创面愈合，其机制是通过增强MMP-11表达，促进调节胶原合成，减少愈合中不受控制的纤维化，维持细胞外基质的稳态。

2.4 膜型MMPs MMP-14位于细胞表面，切割细胞周围的胶原纤维[20]，对创面愈合的生理病理过程至关重要。成纤维细胞中的MMP-14表达在成人皮肤胶原重塑中起关键作用，有助于纤维化皮肤病中真皮内稳态[21]。MMP-14还能与proMMP-2和TIMP-2形成复合物，激活MMP-2，复合物成分比例的任何变化可能导致基质降解变化。另外，MMP-14激活MMP-13，通过降解产生的Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白调节创面愈合、血管生成和炎症反应。Pincus等[11]局部应用17β-雌二醇治疗雌激素缺乏的糖尿病创面，发现MMP-14活性降低，MMP-14表达降低不仅调节MMP-2和MMP-13活性，也减少基质降解，增加胶原含量，促进创面愈合。

2.5 基质溶解素类 MMP-26能切割纤连蛋白、玻连蛋白、纤维蛋白原、Ⅳ型胶原、明胶、α2-巨球蛋白和α1-蛋白酶抑制剂，还可激活proMMP-9，促进切割蛋白。研究发现，MMP-26在创面愈合的角质形成细胞中表达上调[22]。Pirilä等[7]报道，慢性糖尿病创面中，MMP-26在上皮基底膜区域下方及皮下神经处都有表达，经过体外口腔黏膜角化细胞实验，提示MMP-26对正常细胞迁移非常重要。但由于MMP-26在啮齿动物中无法表达，还需人类标本进行更多病理生理学研究，探索MMP-26的作用机制。

3 TIMPs在糖尿病皮肤创面愈合中的作用

TIMP-1可在切除伤口和人类烧伤部位上皮细胞中检测到，在伤口成纤维细胞尤其是血管周围发生转录。Lao等[23]发现，糖尿病皮肤组织和糖基化终末产物处理的人成纤维细胞中TIMP-1的表达均显著降低，采用活性蛋白TIMP-1处理人成纤维细胞后，发现活性蛋白TIMP-1有效促进细胞生长，减少细胞凋亡；采用TIMP-1载体介导基因治疗糖尿病大鼠创面后，观察到愈合明显改善，提示TIMP-1促进糖尿病创面愈合。Ambrosch等[24]对8例耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染患者的糖尿病足进行达托霉素抗感染治疗，发现14 d后创面TIMP-1表达增加，创面面积收缩，提示达托霉素抗感染治疗可通过增加TIMP-1表达促进愈合。Ayuk等[25]采用660或830 nm激光照射体外培养的糖尿病患者皮肤成纤维细胞，8 h后发现TIMP-1表达增加，提示激光照射可增加TIMP-1表达，减少基质降解，促进糖尿病创面愈合。Guillemin等[16]使用GBT013敷料提高糖尿病小鼠慢性创面中TIMP-1的表达，有助于创面愈合中组织重塑。

4 MMPs/TIMPs比值与糖尿病皮肤创面愈合的关系

MMP-9是正常创伤愈合过程中的主要胶原酶，其过度表达和激活可能导致糖尿病慢性难愈合性下肢溃疡。TIMP-1可结合并抑制MMP-9活性，MMP-9/TIMP-1平衡影响着DFU创面愈合。过高的MMP-9/TIMP-1比值与DFU的溃疡愈合及创面闭合率呈负相关[7]。Li等[26]报道，MMP-9/TIMP-1比值过高提示创面愈合不良，MMP-9/TIMP-1比值可作为入院治疗前评估糖尿病创面愈合情况的预测指标。另外，Li等[1]对32例糖尿病患者DFU取皮肤活检并行微生物培养，发现MMP-9/TIMP-1比值升高，VEGF表达降低，表明MMP-9/TIMP-1比值过高可能通过降低VEGF表达抑制糖尿病皮肤创面愈合；同时他们发现，感染的DFU组TIMP-1表达降低，其原因可能是由于高葡萄糖条件下，成纤维细胞减少TIMP-1表达、增加MMP-9表达，此外细菌可以诱导炎症细胞因子如IL-4和IL-6分泌，其过度活化可以减少TIMP-1。

MMPs及TIMPs在糖尿病皮肤创面愈合中的作用十分复杂，尽管有大量文献报道，但由于蛋白酶家族过多成员及补偿机制，至今尚未完全阐明它们的影响机制。全面分析MMPs及TIMPs在糖尿病皮肤创面愈合发生发展中的进展机制，对于临床模拟MMPs抑制剂作用控制相关MMPs及细胞因子改善创面愈合有重要意义。