补肾健脾化瘀中药对难治/复发再生障碍性贫血患者骨髓单个核细胞集落形成的影响

华海应，高华强，朱文艳，周晔，王志清，张艳，何广胜

(1南通大学第三附属医院，江苏无锡214041；2江苏省人民医院)

再生障碍性贫血(AA)是一种骨髓造血功能衰竭性疾病，是由功能亢进的T淋巴细胞介导的自身免疫性疾病[1]。采取免疫抑制治疗可以抑制T淋巴细胞，减少造血负性调控因子，抵抗自身免疫反应，从而促进造血功能重建[2]。但有部分患者对免疫抑制治疗无反应，被称为难治性AA；而在免疫抑制治疗有效的患者中，仍有约30%的患者会出现复发。对于难治/复发性AA，除异基因造血干细胞移植外，目前尚无统一有效的治疗方案。而实际上仅30%的AA患者可以找到HLA相合的供体，再考虑到年龄因素，适合造血干细胞移植的患者并不多，这就需要探索新的治疗方法。采用体外半固体琼脂培养骨髓单个核细胞，计数骨髓集落形成数量，可反映AA患者造血祖细胞情况。绝大多数AA患者各系祖细胞均缺乏，造血祖细胞集落形成少[3]。AA属中医“虚劳”“亡血”“血虚”等范畴。中医学认为，血液的生成、运行和功能状态与心、脾、肝、肾有关，其中与脾、肾的关系尤为密切[4]。采用补肾健脾化瘀法治疗AA已成为目前中医药在这一领域的主流认识。我们在中西医结合治疗难治/复发AA方面积累了丰富的临床经验，应用补肾健脾化瘀中药，以当归、淫羊藿、巴戟天、黄芪、菟丝子、人参、黄精及三七等药物为基础方，再根据辨证情况酌情加减，取得较好的临床效果。本研究采用补肾健脾化瘀中药提取物在体外干预难治/复发AA患者骨髓单个核细胞，观察集落形成情况，探讨补肾健脾化瘀中药对难治/复发AA患者骨髓单个核细胞集落形成能力的影响。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择我院2015年8月～2017年7月收治的难治/复发AA患者15例，男9例、女7例，年龄11～61岁、中位年龄24岁。纳入标准：明确诊断为AA，经免疫抑制剂(环孢素A或联合抗胸腺细胞球蛋白)正规治疗6个月无反应者为难治性AA；经正规免疫抑制剂治疗获得缓解后，在环孢素A维持治疗过程中出现任何一系列的外周血细胞计数下降到缓解中位水平的50%以下或需要血制品(红细胞或血小板)输注，为复发AA。排除标准：存在心、肝、肺、肾功能不全；合并其他严重并发症；合并恶性肿瘤；全身情况差，不能耐受骨髓穿刺者；对研究药物过敏者。本研究经南通大学第三附属医院伦理委员会批准，患者及家属均签署知情同意书。

1.1．1 骨髓单个核细胞的提取 无菌条件下采集患者骨髓液5 mL，注入含肝素抗凝无菌试管中摇匀，用RPMI1640液按1∶1稀释，然后按1∶1注入淋巴细胞分离液，1 500 r/min离心20 min，用吸管吸取界面处单个核细胞层，RPMI1640洗涤，离心，计数单个核细胞。用含20%胎牛血清的RPMI1640培养液悬浮，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养2 h，回收单个核细胞备用。

1.1.2 中药试剂购置 黄芪多糖、淫羊藿苷、三七总皂苷、人参二醇由南京景竹生物技术有限公司提供，质量分数分别为：70%、≥85%、90%、95%；巴戟天多糖、菟丝子黄酮、黄精多糖、当归多糖由陕西斯诺特生物技术有限公司提供，质量分数分别为≥95%、90%、85%、90%。

1.2 细胞分组与处理 将骨髓单个核细胞分为中药组、雷帕霉素组、空白对照组。雷帕霉素组加入终浓度25 nmol/L的雷帕霉素；中药组加入当归多糖、淫羊藿苷、巴戟天多糖、黄芪多糖、三七总皂苷、黄精多糖各100 μg/mL，菟丝子黄酮、人参二醇各50 μg/mL；空白对照组加入生理盐水。每孔1 mL，每组设3个复孔。

1.3 红系祖细胞红系集落形成单位(CFU-E)、爆式红系集落形成单位(BFU-E)检测 将骨髓单个核细胞悬浮于IMDM培养基中。培养体系为：40%胎牛血清，0.9%的甲基纤维素，10-5mol/L 2-巯基乙醇，2 U/mL重组人红细胞生成素，1×105U/L链-青霉素，0.3%琼脂，2×105个单个核细胞。按1.3方法进行分组处理，置于5% CO2、37 ℃、饱和湿度培养箱中孵育，10 d后计数CFU-E集落(≥8个细胞)、BFU-E集落(≥50个细胞)。

1.4 粒细胞巨噬细胞集落生成单位(CFU-GM)检测 将骨髓单个核细胞悬浮于IMDM培养基中。培养体系为：40%胎牛血清，0.9%的甲基纤维素，1×105U/L链-青霉素，0.3%琼脂，20 mg/L rhGM-CSF，2×105个单个核细胞。按1.3方法进行分组处理，置于5% CO2、37 ℃、饱和湿度培养箱中孵育，10 d后计数CFU-GM集落(≥50个细胞)。

2 结果

2.1 三组CFU-E集落数比较 中药组、雷帕霉素组、空白对照组的CFU-E集落数分别为(20.02±1.46)、(22.88±1.38)、(3.18±0.23)个，雷帕霉素组、中药组均较空白对照组增加(P均<0.01)，雷帕霉素组与中药组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 三组BFU-E集落数比较 中药组、雷帕霉素组、空白对照组的BFU-E集落数分别为(5.56±1.25)、(6.25±1.14)、(2.51±0.74)个，雷帕霉素组、中药组均较空白对照组增加(P均<0.01)，雷帕霉素组与中药组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 三组CFU-GM集落数比较 中药组、雷帕霉素组、空白对照组的CFU-GM集落数分别为(13.22±1.65)、(15.46±2.82)、(4.47±1.13)个，雷帕霉素组、中药组均较空白对照组增加(P均<0.01)，雷帕霉素组与中药组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

目前AA的治疗常采用环孢素A、抗淋巴细胞球蛋白或抗胸腺细胞球蛋白抑制T淋巴细胞，大部分患者病情好转，但仍有部分患者治疗无效或缓解后复发，原因主要为环孢素A不能抑制T淋巴细胞而发生耐药。目前认为，T淋巴细胞的信号转导途径分为两种：由T细胞受体(TCR)/CD3、佛波醇酯类及伊诺霉素介导的胞内信号转导途径，由白细胞介素-12(IL-12)或联合IL-18或CD28介导的信号转导途径。前者对环孢素A敏感，后者对环孢素A耐药[5]。对于难治/复发性AA，除异基因造血干细胞移植外，目前尚无统一有效的治疗方案。雷帕霉素是一种强有效的新型大环内酯类免疫抑制剂，用于器官移植的抗排斥反应和自身免疫性疾病的治疗，其用于AA免疫治疗时比环孢素的抑制免疫能力强数十倍，与环孢素有良好的协同作用，且能克服环孢素耐药途径[6]。西医治疗AA采用雄性激素及免疫抑制剂，部分患者难以耐受长期服药带来的不良反应，少数患者可出现严重肝肾损害，且长期服药费用昂贵。中医学的基本特点是整体观念和辨证施治，强调对疾病必须有理、法、方、药的系统认识和合理的调治。治病急则治其标，缓则治其本，在AA的治疗中有其独特优势。

中医学认为，血液的生成、运行和功能状态与心、脾、肝、肾四脏有关，其中与脾、肾的关系尤为密切[7]。既往研究认为，AA的辨证倾向于脾虚，但补脾益气治疗效果并不理想。因此我们从肾虚入手，以肾为根本，探讨补肾中药治疗AA的可行性。肾主骨生髓，肾藏精，精血互化，肾精亏虚，骨髓失于充养，不能化生气血，以致唇甲淡白、面色萎黄、乏力、气短、心悸，脑失滋养，导致头晕、耳鸣、健忘；骨髓空虚，腰府失养，致使气虚无力推动血脉运行，腰膝酸软；血虚则血行不畅，导致离经之血不去；瘀阻络脉，致使皮肤瘀点或瘀斑；瘀血不去，新血不能生，致病情缠绵难愈。因此气血不足、肾精亏虚、瘀血内阻是AA的重要病机，治疗宜采用补肾为主的中药。研究显示，补肾阴、补肾阳、健脾化瘀中药治疗AA已取得一定疗效[8]。临床用于治疗AA的补肾阳药包括菟丝子、淫羊藿、巴戟天等，现代药理研究显示，菟丝子改善肾虚排卵障碍的物质基础可能基于其主要成分黄酮的作用[9],淫羊藿苷具有雌激素样、调节免疫、抗炎、壮阳等作用[10],巴戟天多糖亦具有增强机体免疫、改善生殖等作用[11]。用于治疗AA的补肾阴药物有熟地黄、黄精等，熟地黄多糖、黄精多糖均具有调节免疫的功能[12]。用于治疗AA的益气养血药有人参、当归、黄芪等，人参二醇能有效促进造血，改善AA的骨髓抑制，加快造血功能恢复，升高外周血象，同时通过恢复AA小鼠失衡的Th1/Th2/Treg细胞比例而参与调节免疫[13]；当归多糖对造血细胞的增殖、分化有显著刺激作用[14]；黄芪多糖可以诱导培养的成熟DC细胞特异性激活T细胞从而启动细胞免疫[15]，还可以刺激B细胞的活化与增殖来提高机体的体液免疫能力[16]。用于治疗AA的活血药物有三七等，三七总皂苷通过促进骨髓粒系、红系造血祖细胞的增殖，改善骨髓造血组织增生，从而促进血细胞的生成[17,18]。上述诸药合用可兼补肾阴、肾阳虚，健脾化瘀。

AA患者骨髓造血能力差，体外培养骨髓单个核细胞可发现细胞增殖能力降低，集落形成数量减少。本研究采用补肾健脾化瘀中药提取物在体外干预难治/复发AA患者的骨髓单个核细胞，观察细胞集落形成情况，结果显示，雷帕霉素组和中药组的CFU-E、BFU-E、CFU-GM均较对照组增加。表明补肾健脾化瘀中药能够提高难治/复发AA患者的骨髓单个核细胞集落形成，从而恢复骨髓造血功能，与雷帕霉素效果相似。

综上所述，补肾健脾化瘀中药提取物对难治/复发AA患者骨髓CFU-E、BFU-E、CFU-GM具有明显的促增殖作用，补肾健脾化瘀中药提升血细胞的作用可能是通过促进骨髓单个核细胞集落形成、促进骨髓造血祖细胞增殖来实现的。本研究为临床上使用补肾健脾化瘀中药治疗难治/复发AA提供了理论依据。