贞莲增免口服液质量标准研究

杜红娜 ，陆 安 ，贾永兵 ，刘炳炜 ，王洪礼 ，郭永红 ，郭永国 ，刘学杰

（1.河北普德动物药业有限公司 050200；2.石家庄市兽用功能性添加剂工程技术研究中心 050200；3.河北维尔利动物药业集团有限公司 050200）

贞莲增免口服液是在药典方剂《二至丸》[1]基础上进行组方加减，按一定工艺制备而成的口服液，由女贞子、淫羊藿、墨旱莲等中药配方组成，用于提高家禽家畜机体免疫力。为有效的控制产品质量本研究对贞莲增免口服液中淫羊藿、墨旱莲进行薄层色谱鉴别，同时采用高效液相色谱法同时测定女贞子中特女贞苷和淫羊藿中淫羊藿苷两种有效成分的含量，方法准确可行，且专属性强，可为其质量控制提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

UltiMate 3000高效液相色谱仪 （德国Thermo公司），DAD检测器，变色龙工作站；AUW120D型电子天平（日本SHIMADZU公司）；101-1型电热鼓风干燥箱（龙口市电炉制造厂）。

1.2 试剂与对照品特女贞苷对照品

（批号 111926-201605，含量 93.3%），淫羊藿苷对照品（批号 110737-200415）、旱莲苷 A（批号 111886-201503，鉴别用）、墨旱莲对照药材（批号120958-201407）上述对照品及对照药材均购于中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯；娃哈哈水。

1.3 药材

女贞子、淫羊藿、墨旱莲等药材购于安国药材市场，经本公司质控部鉴别均符合《中华人民共和国兽药典》2015版（Ⅱ部）有关项下规定。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 淫羊藿的薄层鉴别

取贞莲增免口服液2mL，加甲醇10mL，超声处理30min，过滤，取滤液作为供试品溶液；取淫羊藿苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液，作为对照品溶液；另按供试品工艺制备不含淫羊藿的阴性样品，同法制成阴性对照溶液；照薄层色谱法 （2015年版药典四部通则0502）试验，吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上。以甲醇——丁酮——三氯甲烷——水（4：6：6：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。日光下检视，供试品色谱中，在与淫羊藿苷对照品色谱相应位置上，显相同颜色斑点。阴性对照无干扰。结果见图1。

图1 淫羊藿TLC图

2.1.2 墨旱莲的薄层鉴别

取本品6mL，加水稀释至25mL，用三氯甲烷振摇提取2次，每次20mL，弃去三氯甲烷液，水液用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20mL，合并乙酸乙酯液，回收溶剂至干，残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作为供试品溶液。另取旱莲苷A对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。另取墨旱莲对照药材2g，加70%甲醇25mL超声处理45min，放冷，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加水25mL使溶解，用三氯甲烷振摇提取2次，每次20mL，弃去三氯甲烷液，水液用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20mL，合并乙酸乙酯液，回收溶剂至干，残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作为对照药材溶液；另按供试品工艺制备不含墨旱莲的阴性样品，同法制成阴性对照溶液；照薄层色谱法（2015年版药典四部通则0502）试验，吸取对照品溶液5μL，对照药材溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷——乙酸乙酯——甲醇——水（30：40：15：3）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以香草醛硫酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰。日光下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照无干扰。结果见图2。

图2 墨旱莲TLC图

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件色谱柱

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈——水；流速：1.0mL·min-1；检测波长 0～30min 为224nm，30～50min为 270nm。柱温：35℃；进样量：10μL；梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

2.2.2 供试品及阴性样品溶液的制备

取本品1mL，置50mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，0.22μm微孔滤膜滤过，即得。按供试品制备工艺制备不含女贞子和淫羊藿的阴性样品，并按供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。

2.2.3 对照品溶液的制备

取特女贞苷、淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1mL含特女贞苷、淫羊藿苷各150μg的混合对照品溶液，即得。

2.2.4 专属性考察

分别精密吸取对照品溶液、阴性样品溶液与供试品溶液各10μL，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。对专属性进行考察。结果表明，阴性样品对测定无干扰，结果见图3。

图3 各成分HPLC色谱图

2.2.5 线性关系考察

称取特女贞苷和淫羊藿苷对照品各10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品储备液。精密量取混合对照品储备液适量，依次用甲醇稀释至浓度 为 10μg·mL-1、100μg·mL-1、150μg·mL-1、200μg·mL-1、250μg·mL-1系列浓度混合对照品溶液，各精密量取10μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积。以特女贞苷和淫羊藿苷浓度为横坐标（X，μg·mL-1），色谱峰峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得回归方程分别为∶特女贞苷：Y＝0.1999X+0.088，（r＝1）， 淫羊藿苷：Y＝0.1624X-0.2974，（r＝0.9997）， 分别在 9.9644～249.1110μg·mL-1、10.1362～253.4050μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.2.6 重复性考察

取同一批样品（批次：20180101），按取样量 0.5：1.0：1.5 的比例分别取样，各平行3份，按供试品溶液制备方法制备，照上述色谱条件测定，分别计算特女贞苷和淫羊藿苷的平均含量及平均含量的RSD值，考察方法的重复性。测得特女贞苷和淫羊藿苷平均含量分别为 7.59mg·mL-1和 3.25mg·mL-1，RSD 值为分别为1.08%和0.47%，表明该方法重复性良好。

2.2.7 精密度考察

取同一供试品溶液，按确定的色谱条件连续进样6次，分别记录特女贞苷和淫羊藿苷色谱峰峰面积，并分别计算峰面积的RSD值，考察方法的精密度。测得特女贞苷和淫羊藿苷色谱峰峰面积RSD值分别为0.33%和0.35%，表明该方法精密度良好。

2.2.8 稳定性考察

取同一供试品溶液，分别于 0，4，8，12，18，24h 进样 1 次，分别记录特女贞苷和淫羊藿苷峰面积，并分别计算峰面积的RSD值，考察方法的稳定性。测得特女贞苷和淫羊藿苷色谱峰峰面积RSD值分别为0.34%和0.67%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.2.9 准确度考察

取同一批样品（批次：20180101）0.5mL，平行9份，分别精密加入高、中、低三个浓度的特女贞苷和淫羊藿苷混合对照品溶液，每个浓度平行3份，按确定的方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样测定，记录峰面积并计算回收率。结果见表2。

表2 各成分加样回收率试验结果（n=9）

上述结果显示：9份供试品溶液中，特女贞苷的回收率均介于98%～102%之间，平均回收率为100.27%，RSD值为1.45%（n＝9），该方法回收率良好。9份供试品溶液中，淫羊藿苷的回收率均介于98%～102%之间，回收率均值为99.51%，RSD值为0.76%（n＝9），表明该方法准确度符合要求。

2.2.10 系统耐用性试验

a.柱温变化对含量测定结果的影响 取供试品溶液，固定其他色谱条件，分别在柱温为30℃、35℃、40℃进行测定，并以特女贞苷和淫羊藿苷混合对照品溶液随行对照，分别计算特女贞苷和淫羊藿苷的含量，比较柱温变化对测定结果的影响，结果见表3。

表3 柱温变化对含量测定结果的影响（n=3）

由上述试验结果可知，柱温变化后，特女贞苷和淫羊藿苷含量测定结果的RSD值均小于2%，说明柱温的变化，对样品含量测定结果影响较小。

b.检测波长变化对含量测定结果的影响 取供试品溶液，固定其他色谱条件，分别在检测波长222 nm，224 nm，226nm测定特女贞苷含量，在检测波长268nm，270nm，272nm测定淫羊藿苷含量，并以特女贞苷和淫羊藿苷混合对照品溶液随行对照，比较检测波长变化对测定结果的影响，结果见表4。

表4 检测波长变化对含量测定结果的影响（n=3）

由上述试验结果可知，检测波长变化后，特女贞苷和淫羊藿苷含量测定结果的RSD值均小于2%，说明检测波长的变化，对样品含量测定结果影响较小。

c.流动相流速变化对含量测定结果的影响 取供试品溶液，固定其他色谱条件，分别以流速为0.8mL·min-1，1.0mL·min-1和1.2mL·min-1，进行测定，并以特女贞苷和淫羊藿苷混合对照品溶液随行对照，分别计算特女贞苷和淫羊藿苷的含量，比较流速变化对测定结果的影响，结果见表5。

表5 流速变化对含量测定结果的影响（n=3）

由上述试验结果可知，流速变化后，特女贞苷和淫羊藿苷含量测定结果的RSD值均小于2%，说明流速的变化，对样品含量测定结果影响较小。

d.流动相比例变化对含量测定结果的影响 取供试品溶液，固定其他色谱条件，分别以不同比例甲醇——水为流动相，以特女贞苷和淫羊藿苷混合对照品随行对照，分别计算特女贞苷和淫羊藿苷的含量，比较流动相比例变化对测定结果的影响，结果见表6。

表6 流动相比例变化对含量测定结果的影响（n=3）

由上述试验结果可知，流动相比例变化后，特女贞苷和淫羊藿苷含量测定结果的RSD值均小于2%，说明流动相比例的变化，对样品含量测定结果影响较小。

e.不同型号色谱柱对含量测定结果的影响 按确定的方法制备供试品溶液，分别用3根不同型号色谱柱按确定的色谱条件测定特女贞苷和淫羊藿苷的含量，比较不同型号色谱柱对测定结果的影响，结果见表7。

表7 不同型号色谱柱对含量测定结果的影响（n=3）

表8 中间精密度考察结果（n=6）

由上述试验结果可知，流动相比例变化后，特女贞苷和淫羊藿苷含量测定结果的RSD值均小于2%，说明不同型号色谱柱对样品含量测定结果影响较小。

2.2.11 中间精密度考察

按已确定的方法，分别由不同人员在不同时间、不同仪器测定同一批次口服液中特女贞苷和淫羊藿苷的含量，每次试验平行取样6份，对中间精密度进行考察。结果见表8。

由上述试验结果可知，由不同人员在不同时间、不同仪器测定同一批次样品中特女贞苷和淫羊藿苷含量的RSD值均小于2%，表明该方法中间精密度良好。

2.3 样品测定

取5批样品，按 “2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下测定，计算含量。结果见表9。

表9 各成分含量测定结果（n=3）

3 结语

本研究参考药典[1]及淫羊藿文献［2～5］、墨旱莲文献［6～8］，通过TLC薄层色谱条件的摸索，分别筛选出最佳展开条件，完成淫羊藿和墨旱莲TLC鉴别标准的制定；与此同时，对“女贞子”的鉴别也进行了考察，但初步摸索发现阴性样品存在干扰，通过调整展开剂系统及供试品溶液制备方法［9～12］，均未得到较好的检测结果。经查阅文献［13］发现，淫羊藿中存在齐墩果酸成分，这可能是造成阴性干扰的原因。因此，女贞子的鉴别未载入质量标准，下一步科研有待深入研究。

中药复方制剂所含成分复杂多样，仅对其中单一成分进行检测，不能全面反映中药制剂的物质基础和化学成分群的复杂性，也无法体现制剂整体质量情况。近年来，随着现代科学技术的发展，分析技术的不断提升，中药复方质量评价由单一指标性成分检测体系向多组分检测体系发展［14］。在贞莲增免口服液中，淫羊藿苷为淫羊藿主要有效成分，特女贞苷为女贞子中环烯醚萜类的主要活性成分，因此，本研究建立了HPLC同时测定特女贞苷和淫羊藿苷含量的高效液相色谱法。对特女贞苷、淫羊藿苷对照品进行全波长扫描时发现，前者在224nm有最大吸收，后者在270nm有最大吸收，同文献［15］结果一致，故确定检测波长为224nm和270nm，采用波长切换HPLC同时测定特女贞苷和淫羊藿苷的含量。

本研究将药典组方“二至丸”进行组方调整制备口服液，由丸剂到口服液剂型的改变，使用更方便，便于体内消化吸收，为了确保其质量及用药安全，通过TLC定性鉴别和HPLC定量测定来进行质量控制研究。结果表明质量控制方法准确可靠、专属性高，可为贞莲增免口服液制剂提供有效的质量控制方法。