循环肿瘤细胞在肺癌诊疗中的临床应用与进展

孙婧怡 马礼兵

桂林医学院附属医院呼吸与危重症医学科，桂林医学院呼吸疾病研究所，广西壮族自治区教育厅高校呼吸疾病重点实验室（广西桂林 541001）

肺癌在近50年来是许多国家中发病率和病死率增长最快的恶性肿瘤之一，极大的威胁着人们的健康和生命。根据肺癌在疾病诊断之前常转移的特点，远处转移肺癌患者的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）更是显着降低［1］。目前肿瘤的临床诊断仍以固体活检为确诊肿瘤组织学及其分期的金标准，但实际操作有一定的限制并存在风险性，特殊位置及一些转移部位的肿瘤通常可能无法进行活检，且肿瘤的异质性并不能被固体活检完全捕获。临床实践中，肿瘤活检标本的目的是预测和评估治疗反应的特异性生物标志物，并且在同一原发肿瘤的解剖学上不同部位及其转移灶显示的遗传图像也不尽相同［2］。显然，固体活检不足以对进展期肿瘤的异质性进行表征，更不会产生完善的基因组图像［3］。近年来，液体活组织检查——即液体活检以非入侵的方式引起了研究者们的极大关注，其得益于可对患者进行多次采样且风险性极低。液体活检的研究领域是通过提高从正常周围血细胞中分离循环肿瘤细胞（CTC）的富集分析的灵敏度和特异性从而对肿瘤基因型进行遗传分析，以便更好的对患者进行分类分层干预治疗并有效的监测患者反应［3］。此方法不仅能改善临床预后，更可通过提供适合患者肿瘤基因构成的特定药物来达到“个性化”治疗的目标。

更多研究表明，通过分析患者血浆或血清中肿瘤特异性遗传改变可改善肿瘤患者的预后，并可对靶向治疗期间所产生的获得性药物抗性突变进行检测。在基因突变的评估方面可通过重复活检来阐明分析肿瘤进展的分子生物学特征，尤其在NSCLC的诊疗中［4］。因此作为“液体活检”的CTC被誉为肿瘤基因组的潜在替代物。过去十年中，越来越多研究表明CTC在NSCLC的诊断、治疗、疾病监测及预后目的中起到重要作用［5］。为了更好的了解CTC在早期和晚期癌症患者的诊疗及预后中的作用，以及其与固体活检的区别，以下将对近年来CTC在肺癌诊疗中的临床应用与进展做简要阐述和讨论。

1 CTC概述

CTC是存在于癌症患者外周血中各类肿瘤细胞的统称，这个概念是由澳大利亚籍医生Thomas Ashworth于1869年首次提出的，其特异性分子检测在近几年开始受到高度关注［6］。CTC为罕见的上皮细胞，每106～109个血细胞发生率约为1 CTC，由不同表型、基因组和功能特征的细胞组成［7］。大部分CTC因自发或诊疗操作从原发或转移的肿瘤病灶脱落进入循环，在外周血发生凋亡或被吞噬，而逃逸的少数肿瘤细胞可通过上皮-间质转化诱导细胞表型的改变，进而致使上皮标志物的下调并增加其侵袭和迁移的能力［8］。当肿瘤＞2 mm3时更易于黏附或穿过血管壁，从原发肿瘤中分离出的肿瘤细胞进入血管系统并循环到远处，最终以“自我播种”的过程发展为远处转移灶促进癌症进展［6］。据研究推测，CTC是有选择的向血液中进行释放，在经过循环系统的过程中，CTC的迁移与巨噬细胞、血小板、以及趋化因子都密切相关［9］。由于CTC含有原发性肿瘤的表型和遗传信息，通过分离捕获CTC对转移性和非转移性肿瘤进行液体活检引起了研究者们极大的关注。为平衡CTC隔离技术的发展和临床实践之间的关系，CTC分离方法的特异性、灵敏度、纯度及生存力等关键因素是需要被考虑的，它们决定了后续的分子和基因组分析以及用于离体药物测试的培养［9］。CTC不仅可以在已发生远处转移的患者血液中被检测到，且高效的CTC分离方法对早期发现微小肿瘤具有可观的前景。新分子生物标志物的不断发展对肺癌患者治疗具有突破性进展，在肺癌个性化治疗面前，液体活检可以说是一个重要的转折点。CTC突变分析的评估能够“实时”的进行调控和监测治疗效果，这对未来肺癌的治疗提供了有力前景。

2 CTC与肺癌

目前液体活检是肺癌研究领域一个新的扩展领域，可提供早期诊断并预估转移复发和进展风险，对其药物治疗进行实时监测和鉴定。在高风险肺癌患者中，可通过CTC进行早期疾病检测；在晚期肺癌患者中，重复进行液体活检分析CTC的分子特征对其疾病进展也至关重要［10］。因此，CTCs检测和计数可应用于肺癌患者的早期诊断、治疗靶点的识别、耐药机制的实时监测和预后等。

2.1 CTC在肺癌耐药突变诊断和鉴定中的作用目前分子鉴定是NSCLC治疗选择的关键步骤，CTC可表征单个活肿瘤细胞的“组学”，或产生基于CTC的细胞系来研究转移机制，是下游分析的理想选择［11］。经大量研究表明在NSCLC患者的血液样本中，表皮生长因子受体（EGFR）基因的突变和其所匹配的原发肿瘤组织活检相一致［12］。目前在指导临床药物选择方面可通过针对CTCs检测基因突变和药物敏感性的方法。PUNNOSE等［13］通过定量PCR的方法分析在NSCLC患者的CTC对于EGFR突变状态的检测，虽然其灵敏度较低，但仍可发现检测结果与肿瘤活检的结果一致；BREITENBUECHER等［14］也应用RT-PCR检测应用TKI治疗的肺癌患者血液中EGFR外显子19的缺失，发现突变状态的CTCs增加也许表明发生了EGFR TKI抗性以及有疾病复发的预兆；同时发现肺癌患者血液样品中CTC数量的增加与肿瘤进展有关，出现新的EGFR突变随之其细胞数量也增加［15］。另外有研究显示，在NSCLC患者的CTCs中，检测发现EGFR（T790M）位点的突变则该患者会对吉非替尼或厄洛替尼的治疗产生耐药，进而导致疾病的不良预后和进展［12］。这些都说明了CTCs在EGFR突变的检测中可以发挥改善肺癌治疗方案的作用。除EGFR基因突变外，据统计在所有NSCLC患者的病例中约2%～7%发生ALK基因重排，因此进行评估筛选ALK基因重排的肺癌患者是必要的［16］。PAILLER等［16］对ALK阳性组和阴性组的NSCLC患者通过应用过滤富集技术和荧光原位杂交技术进行评估，结果显示阳性组患者血液在每1 mL中含4个或更多具有ALK基因重排的CTC，而阴性组患者几乎未检测到。在克唑替尼治疗期间发现，其中5位含有ALK重排的CTC患者中有4位在治疗期间携带ALK重排，这对NSCLC患者在接受克唑替尼治疗时进行实时评估其CTC中ALK基因重排的存在具有重要的意义［16］。此外在药敏检测方向上，YU等［17］通过对部分药物研究发现CTCs敏感的药物有紫杉醇和卡培他滨，而其耐药的药物有氟维司群和奥拉帕尼。可以说CTC药物敏感性测试揭示了其潜在新治疗靶标，通过优化CTC培养条件可更好调整个体肺癌患者疾病过程中的最佳疗法。

这些研究均说明了CTCs可有助于肿瘤异质性的评估且CTC基因组可预测癌症进展，在出现抗药时进行替换针对治疗。实时掌握肺癌患者的耐药性和复发相关的重要数据对其分层指导靶向治疗至关重要，这为肺癌患者的诊断和治疗提供了新的视角，极具研究价值。

2.2 CTC在肺癌的治疗监测方面目前研究显示“液体活检”在肺癌的治疗检测方面具有潜在发展。应用免疫药物治疗肺癌的历程中，评估CTC的肿瘤反应是目前广泛研究的问题。NICOLAZZO等［18］通过在应用基于抗程序性死亡受体-1（抗-PD-1）的nivolumab药物治疗的肺癌患者中，富集分离CTC进而评估程序性死亡配体-1（PDL-1）的蛋白表达，得出了CTC作为预测的标志物与抗-PD-1药物的相关性。经研究发现在治疗6个月后可在所有患者血液中检测到CTC，且检测到PDL-1阳性的CTCs和肿瘤的不良进展密切相关［18］。此发现证明了CTC在预测nivolumab药物对肺癌治疗反应的潜在应用，不足之处在于目前实验队列不够大。CTC的监测在肺癌的靶向治疗方面表现出其重要作用。目前最常见的是EGFR基因突变、ALK和ROS-1基因重排相关的肺腺癌（AC）［19］，还有包括BRAF、AKT1、ERRB2、PIK3CA和RET的基因组畸变［20］。CTC在“液体活检”中弥补了组织活检不能充分反映肿瘤细胞异质性的特点，更有利于对疾病的进展进行动态监测［21］。MARCHETTI等［15］通过CTC检测EGFR原发性肿瘤患者的突变检出率为84%，其余与原发肿瘤不匹配的突变推测是来源于肿瘤的异质性。同样用相似的方法在研究NSCLC CTC中ALK重排和ROS1重排的过程中，与组织活检标本进行比较发现都可检测到相同突变基因的CTC［19］。因此可推断CTC的基因组对肺癌具有预测作用，进而可以针对性治疗其出现的继发性抗药。

迄今为止，CTC在肺癌远处转移的诊断中的作用及与临床分期间的关系众说纷纭。KURUSU等［22］分别对IIA，ⅡB和ⅢA期的癌症患者治疗前血液中的CTC进行检测分析发现其癌胚抗原的检测率明显较IA和IB期升高；而WENDEL等［23］对非小细胞肺癌患者化疗前的血液样本进行CTC检测分析，发现临床分期与患者的CTC计数并无明显差别。还有研究显示CTCs与小细胞肺癌患者PS评分、临床分期、有无远处转移、NSE及LDH水平有关，因此检测CTCs有利于更精确的病情评估［24］。不同研究结果提示仍需大量样本进行多次实验才能广泛应用于临床监测，但确定的是通过CTC连续监测肺癌的治疗反应极具价值和研究前景。

2.3 CTCs在NSCLC中的预后意义在NSCLC患者中，目前CTCs可在其各个阶段检测到，因此动态变化的CTC可以反映NSCLC患者的预后［16］。KREBS等［25］通过对先前未经治疗的Ⅲ/Ⅳ期NSCLC患者进行了标准化疗周期前后的CTCs进行富集分析，发现CTC计数Ⅳ期患者高于Ⅲ期，进而推断CTC的数量与NSCLC患者的预后呈负相关，即CTC数量越多患者的预后越差且生存时间越短。另外在早期肺癌中，手术前后检测到CTC的升高与肿瘤的进展恶化也有关。BAYARRI-LARA等［26］通过对NSCLC根治性手术治疗的患者进行了CTC的评估，发现术后CTCs的数量与复发率和PFS呈负相关；我国研究者对晚期NSCLC患者的CTCs进行预后分析［27］，其中87%的患者检测出CTC，得出了基线CTC＞8时可作为患者PFS和OS降低的预测指标；CHINNIAH等［28］报告中显示48例进行CTC检测的晚期NSCLC患者的随访记录，近70%的患者在临床证实复发之前6个月表现出CTC计数升高。同时CTC作为“实时”液体活检可随时监测肿瘤治疗进展，在冷冻治疗中CHUDASAMA等［29］对晚期NSCLC患者进行了手术前后其外周血CTC脱落的计数，发现术后CTC数量升高提示其预后不良。以上研究均表明，CTC计数不仅是在预后，其在治疗过程中不断监测CTC的动态变化更有利于观测疾病的进展情况。

在上述研究中发现，在NSCLC的药物化疗、放疗和手术后CTC的计数以及动态变化均可应用于预后的指标。而CTC检测目前并未划为常规检查的原因主要有两点：（1）CTC的检测方法目前都有待完善，各有利弊，其灵敏度及纯度都有待提高；（2）大部分研究都基于小的样本量，需大量数据提供有力证据。但基于现有实验可以证实CTCs在NSCLC中具有相对可靠的预后因素，通过改善其检测方法可更好的应用于临床研究。

3 讨论

综上所述，肺癌患者尤其是在NSCLC患者的治疗研究中目前最新进展就是分子生物标志物的发现与检测。经多项研究证明，在肺癌的靶向治疗针对疾病进展过程中患者出现耐药的情况，CTC具有可实时检测到EGFR突变或ALK重排等可随时间变异的肿瘤基因的遗传异质性［30］。相对于传统组织活检单点取样只能定格标本的特点，通过CTC计数来评估NSCLC患者的预后是一项重大突破，这些在肺癌的治疗过程中对其进行“实时”监测、对抗性标记物的早期检测、预测患者结果、并调整治疗方案和改善治疗干预措施具有重要意义。作为一种新型替代生物标志物CTC对肺癌的预后价值不可估测，且在未来遗传学研究中CTC检测的液体活检的方式还可提供大量有价值的信息。在药物经济学评估中，液体活检在癌症治疗的有限预算中可能是兼具性价比的有前景的筛查手段［31］。

然而，CTC的检测并未广泛应用于临床也是由于这个领域有很多问题依然有待解决。CTC更多的是处于早期阶段有其局限性，例如CTC检测采样系统的标准化、技术可应用于临床常规筛查的实用性、下游对CTC进行分析的可靠性以及CTC计数和放射成像之间可能的关联性等。当然除CTC外，进一步发掘新的液体活检标志物如血小板、ctDNA、exosomes、secretome等，同时将其与临床实践紧密相连，建立癌症患者的新型标志物样本数据库，这对未来癌症患者的诊疗具有深远意义。总之，CTC的发现以及其临床研究为肺癌的精准治疗开启了崭新的大门，在不断的探索实践中液体活检技术及肺癌患者的个性化治疗将广泛应用于临床。