蚊虫对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性研究进展

徐鑫 钱坤

蚊虫由于其特殊的行为、生理结构以及与人类生活关系紧密而成为传播人类疾病(疟疾、丝虫病、登革热等)的重要媒介，是重点防治的医学昆虫之一。目前化学防治仍然是蚊虫防治的主要手段，其中拟除虫菊酯类杀虫剂是蚊虫防治中使用较多的化学药剂，自20世纪广泛使用以来，蚊虫对其抗性水平逐步提高，抗性问题逐渐成为人们关注的重点问题。本研究主要从蚊虫对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性现状、抗性风险评估和抗性机制进行综述。

1 蚊虫对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性现状

我国自20世纪70年代初开发拟除虫菊酯类杀虫剂以来，拟除虫菊酯类药剂便因其对人畜、环境友好、安全的特点被大力推广使用，然而抗药性问题也随之出现。据调查，至1987年淡色库蚊种群对溴氰菊酯、氯菊酯、胺菊酯和速灭菊酯等抗性区已占27个监测点的50%以上，且其抗性发展动向超过了有机氯和有机磷类杀虫剂［1］。近年来，在全国范围内蚊虫对常用拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗性的报道不断。徐建敏等［2］2014年调查发现广州市荔湾区的白纹伊蚊对氯菊酯已产生较强抗性，并且另外两个区成蚊对拟除虫菊酯类药剂的抗性也在逐渐产生。此外，众多学者在过去几年间的采集与调查发现北京、河北、河南、江西以及山东多个城市的蚊虫对于拟除虫菊酯类杀虫剂都产生了不同程度的抗性，且抗性水平正在逐步提高。另外，值得注意的是，李庆凤［3］通过研究发现，经过氯氰菊酯处理过的淡色库蚊的幼虫抗性高于成虫。多项研究证明，蚊虫对于拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性问题已十分严重。

此外，有研究表明，蚊虫也极易对拟除虫菊酯类杀虫剂产生交互抗性。调查表明，对于一种媒介蚊虫，一旦其由于各种因素对某一种或某一类拟除虫菊酯类药剂产生了一定的抗性，其在很大程度上也会对同等作用机制的其余拟除虫菊酯类药剂产生交互抗性。寇景轩等［4］研究发现蚊虫对氯氰菊酯、溴氰菊酯和三氯杀虫酯这三种常用杀虫剂存在着交互抗性，且利用一种拟除虫菊酯类药剂选育的蚊虫易对其余拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗性，但不同拟除虫菊酯类杀虫剂混合选育，蚊虫抗性发展则有所不同。同样地，李向东等［5］研究发现抗氯氰菊酯品系对敌敌畏以及残杀威均可产生低度交互抗性。多项调查表明，蚊虫一旦对一种拟除虫菊酯类杀虫剂产生高抗性后，便会大大影响许多同等作用机制的拟除虫菊酯类杀虫剂的实用价值，需要合理施用该类药剂，避免产生交互抗性。

2 蚊虫的抗药性风险评估

在室内进行抗性风险评估工作是目前进行抗性治理的主要手段，尤其是一种药效较好的药剂进入市场之前，对其进行合理的风险评估工作，可以有效预测其对于靶标害虫抗性发展的动态情况，降低盲目用药带来的风险，对于制定合理、安全的抗性治理方法，具有极为重要的意义。目前，我国关于蚊虫抗药性风险评估报道不多，宋锋林等［6］以淡色库蚊的敏感与抗性品系为材料，分别使用溴氰菊酯和ES－生物丙烯菊酯两种拟除虫菊酯类药剂对其进行逐代筛选，并采用现实遗传的研究方法，计算抗性筛选后品系的现实遗传力情况，并对这两种药剂的抗性风险进行室内评估，结果表明:在实验室条件下，溴氰菊酯品系抗性发展速率显著快于ES－生物丙烯菊酯品系，其抗药性上升潜力也大于ES－生物丙烯菊酯品系。淡色库蚊自然种群对ES－生物丙烯菊酯不易产生高抗药性，但对溴氰菊酯易产生高抗药性。刘洪霞等［7］经过17代的室内选育，发现白纹伊蚊对溴氰菊酯的抗性可达到36.7倍，白纹伊蚊对溴氰菊酯的抗性 h2为0.1257，抗性风险较大，并且根据抗性发展规律，可以预估其抗性上升十倍的代数，从而可以探究溴氰菊酯对白纹伊蚊的抗性风险，为药剂的进一步研究奠定基础。

3 蚊虫对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性机制研究

3.1 代谢抗性

3.1.1 细胞色素: P450氧化酶系(P450 s):P450 s氧化酶系是硫醇盐蛋白的超家族，可参与多种物质的代谢解毒过程，是害虫代谢抗性最主要的机制之一。P450 s在昆虫中主要是对昆虫激素(包括保幼激素与蜕皮素)的合成与分解，对杀虫剂以及植物毒素等化合物的活化和解毒起作用。因此，细胞色素P450是许多代谢途径中的重要解毒酶。关于细胞色素P450与昆虫抗药性的关系，最早发现的是P450抑制剂sesamax能够逆转昆虫对西维因的抗性。体内实验证明sesamax是P450的抑制剂，随后体外实验也予以证实细胞色素P450与昆虫对药剂西维因产生抗性有关。以往的众多研究结果证实:与P450氧化酶系相关的抗性害虫常常能够表现出某种P450的过量表达。如异源表达的 CYP6A1，CYP6A2，CYP6D1等具有对杀虫剂代谢的活性直接证明了这些P450的过量表达在杀虫剂抗性形成中起作用。

在如今已鉴定的昆虫 P450家族中，大多认为CYP6家族与杀虫剂抗性的产生有着密切的关系，但是随着研究的进行，CYP4、CYP9和CYP12家族等也渐渐进入人们的视野。曹俊等［8］研究发现两种增效剂(PBO、TPP)对嗜人按蚊敏感品系和不同程度的抗性品系都有增效作用，故其猜测嗜人按蚊对于溴氰菊酯的抗性机理可能是解毒酶活力增强引起的，多功能氧化酶可能起着重要作用。LIU等［9］通过研究证实对拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗性的致倦库蚊体内CYP6AA7、CYP9J40、CYP9J34 和 CYP9M10 含量在致倦库蚊不同生长阶段都呈现显著表达，且抗性水平越高的品系，表达水平也越高。STEVENSON等［10］研究发现抗性品系蚊虫体内存在CYP9JS过转录的现象，其中以 CYP9J24、CYP9J26、CYP9J28和CYP9J32与拟除虫菊酯类杀虫剂抗性关系较为密切。KASAI等［11］利用PCR(q RT-PCR)技术检测到埃及伊蚊体内的2个P450亚型为CYP96M6和 CYP6BB2，且其P450表达水平和氯菊酯降解速率一一对应，由此得出细胞色素P450单氧酶(P450 s)在抗性发育过程中起着重要作用，且体外代谢研究也表明P450 s与耐药性有关联。Toé等［12］在西非研究发现抗拟除虫菊酯类杀虫剂品系的蚊虫体内的 CYP4G16、CYP6P1、CYP9J5、CYP6Z3、CYP9M1以及 CYP6P4均呈现显著表达。JEFFREY等［13］研究表明CYP9M10在蚊虫对拟除虫菊酯耐药性中一直被过度表达。以上研究可以充分证明P450 s基因的点突变、过转录和高表达等现象是造成蚊虫P450 s解毒代谢增强的重要机制。

3.1.2 非专一性酯酶(ESTs): ESTs在蚊虫对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性中发挥重要作用。编码 ESTs的基因点突变、扩增和表达量增加是蚊虫产生抗性的重要分子机制，其中羧酸酯酶起着重要作用。羧酸酯酶是自然界多数昆虫体内含有的一类重要解毒酶系，其主要是利用水解蛋白和结合蛋白这两种主要方式对药剂进行解读，而随着代谢解毒过程的进行，抗性也往往随着羧酸酯酶活力的升高而产生，羧酸酯酶活力测定在如今应用较多的拟除虫菊酯类杀虫剂的代谢中发挥着尤为重要的作用［14］。国内已有部分研究表明蚊虫抗性机制与羧酸酯酶有一定联系，徐建敏等［2］研究发现白纹伊蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂的代谢速率与其体内羧酸酯酶的活性高低存在一定的联系，吴能简等［15］研究发现随着羧酸酯酶活性的上升，白纹伊蚊对于氯菊酯的抗性水平也有一定的提高。

国外也有相应研究，FAUCON等［16］研究表明，泰国抗拟除虫菊酯类杀虫剂品系的埃及伊蚊体内的3个羧酸酯酶(CCEae3a、CCEae4a和CCEae6a)均发生了变异。POUPARDIN等［17］在泰国研究发现:在埃及伊蚊各种群中扩增水平较高的拟除虫菊酯类杀虫剂抗性的那空沙旺(NS)种群中，抗性品系CCEae3a比敏感品系表达上调了60多倍，此外，CCEae6a表达也存在上调的现象，CCEae3a的测序和模拟结构预测显示:NS种群抗性增加与几种氨基酸的多态性也有一定关系。这些研究进一步证明由于编码基因扩增造成的羧酸酯酶表达上调，是蚊虫解毒代谢增强的重要机制。

3.1.3 谷胱甘肽S－转移酶(GSTs): GSTs是一种多功能解毒酶系，可参与多种有毒物质的解毒代谢过程。目前，蚊虫 GSTs分为7个亚族，其中 Delta和Epsilon是蚊虫特异性亚族，已鉴定的蚊虫抗药性相关基因主要分属于这2个亚族［18］。GSTs可以参与蚊虫对于拟除虫菊酯类药剂的抗性产生过程，在非洲中、西部，DDT和氯菊酯交叉抗性的致死按蚊中也发现GSTE2高水平表达，并通过全基因转录组的功能分析、结构种群遗传学的研究，证实其高表达是由GSTE2的单氨基酸(L119F)改变联合转录增加造成［19］。此外，据 JONES 等［20］研究表明，布基纳法索城区内对 DDT产生抗性的阿拉伯按蚊(An.Arabiensis)体内的GSTD3表达上调，通过这一研究可以证明GSTs基因表达上调是导致GSTs解毒代谢增强的主要机制。

3.2 靶标抗性 钠离子通道是几种神经毒剂的分子靶标，这些神经毒剂具有高度的亲和性与选择性，可以与钠离子通道专一的结合位点结合而改变钠离子通道的功能。神经毒理学研究表明:拟除虫菊酯引起神经兴奋性毒性是因为延迟神经细胞钠离子通道的关闭，也就是拟除虫菊酯占领钠离子通道结构域Ⅱ和Ⅵ的S6片段(位于钠离子通道内外两侧之间的疏水性区域)，从而延迟钠离子通道的失活过程，产生持久的活化，导致重复后放并阻断了神经传导。NATAHASHI等［21］研究表明拟除虫菊酯类杀虫剂主要作用于蚊虫的钠离子通道，引起钠离子通道内氨基酸结构发生一定变异，从而延缓了钠离子通道的关闭，使钠离子不断向内流失，进而引起蚊虫神经冲动的重复后放，与此同时还阻断了突触传递的进行。

刘宏美等［22］利用PCR以及AS-PCR等技术研究发现淡色库蚊kdr基因突变与溴氰菊酯抗药性发生存在一定关系。SINGH 等［23］利用 PCR(PIRA-PCR)技术，对印度地区53个浅色按蚊体内的SC靶标(L1014的ⅡS6结构域)进行了DNA测序，结果显示在亮氨酸1014的第3密码子上，明显存在着2个非同义突变:A＞C与A＞T，两种突变直接导致亮氨酸(TTA)被替换成苯丙氨酸(TTT或TTC)，三种等位基因TTA、TTT和TTC的发生频率分别为0.14、0.19和0.67，由此结果可以求得编码苯丙氨酸等位基因发生频率为0.86。此外，浅色按蚊亮氨酸kdr基因座中的A＞C突变比A＞T突变具有更加重要的意义，由此可以直接证明蚊虫靶标抗性的产生与靶标SC上的点突变引起的关键部位氨基酸交换存在密切关系。王学军等［24］研究发现野外种群淡色库蚊对溴氰菊酯抗性水平与kdr等位基因频率存在显著的相关性，然而高效氯氰菊酯、氯氰菊酯抗性水平与kdr等位基因频率无显著相关性，存在一定差异。

3.3 表皮抗性 表皮抗性的发生机制主要是由于蚊虫自身表皮的影响，导致药剂穿透表皮效率降低，延长药剂作用到靶标部位的时间，从而降低了药剂在蚊虫体内的有效浓度，时间一长便引起了蚊虫的抗性。表皮抗性与蚊虫抗性代谢存在一定的正相关性，主要是由于蚊虫表皮的增厚可以使其容纳下药剂中更多的酯类成分，对于药剂的穿透起到了一定的限制作用，对于其提升抗药性起到了一定的促进作用。近年来，FANG等［25］研究发现在淡色库蚊的溴氰菊酯抗性品系和敏感品系中，通过蛋白质组学和转录组发现了14种表皮蛋白(ICPs)，接着通过 qRT-PCR检测发现无论是实验室种群还是野外种群，抗性品系的CpCPLCG5基因的表达水平均远远高于敏感品系，但是其余13种表皮蛋白均表现下调现象。另外，用小干扰RNA(siRNA)敲除 CpCPLCG5基因时发现抗性品系的敏感性明显增强，然而其他13种表皮蛋白却又表达出上调的现象，从而可以表明淡色库蚊表皮抗性的产生与其表皮蛋白的表达上调存在明显关系。另外，李庆凤［3］对淡色库蚊 SS品系和 CR品系的幼虫和成蚊的抗性进行了测定，结果表明幼虫的抗性要明显高于成虫，探究发生原因可能是由于幼虫与成虫体内代谢水平和对外界环境的适应程度存在一定差异，幼虫由于长期生活在水中，随着通过表皮渗透进的药剂有效成分的增多，幼虫对药剂也逐渐适应，进而产生了较高水平的抗性，而成虫由于接触部位以及表皮厚度不如幼虫等因素，表现出来的抗性水平可能就不如幼虫。

4 讨论

由于早期人类大量使用杀虫剂的原因，如今蚊虫抗性问题已成为一个世界性难题，所以对蚊虫进行室内风险评估工作和抗性机制的研究显得格外重要。国外学者HARDSTONE等［26］研究表明蚊虫抗性产生不仅仅是单一作用，还可能存在不同抗性机制间的相互作用，且LIU等［27］研究表明杀虫剂的易感性变化水平不应基于单一的评估方法，由此可见蚊虫抗药性问题研究较为复杂。但是随着人们对于分子生物学研究的不断深入，对于蚊虫抗性的产生，发展过程也开始从基因层面进行深入探索，对蚊虫抗性品系基因的分离、克隆以及表达差异等方面的鉴定，可以很好的从分子角度研究蚊虫抗性产生机制。然而目前国内外关于蚊虫抗性遗传方式的系统性研究报道较少，因此开展相应药剂抗性风险评估工作以及抗性机制的研究工作对于开展抗性治理具有重要的指导意义。

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