梧州桑寄生茶中槲皮素提取工艺优化

杨红梅，田春林，梁燕妮，卓梅芳，陈超杰，陈小敏

(1.2.3.4.5.6.梧州学院，广西 梧州 543002)

桑寄生的主要功效是祛风湿、补肝肾、强筋骨，主要成分为黄酮类化合物，其中槲皮素含量最高，槲皮素作为药物具有抗自由基、抗氧化、抗菌、抗病毒等作用[1]。超声辅助提取法是指利用超声波对植物细胞进行破坏，加速溶剂浸入和有效成分溶出的样品前处理方法，与传统的回流提取、浸渍提取等相比，超声辅助提取法具有提取率高、用时短和防止有效成分热分解等优势[2]，已广泛用于中药材中黄酮类、皂苷类、生物碱等活性成分的提取[3]。

《中国药典》(2015版)桑寄生中槲皮素采用回流法提取，此方法在中药提取中应用较多，但存在耗时长、提取率低、破坏活性成分等缺点。本研究采用超声辅助法提取梧州桑寄生茶中的槲皮素，分别在提取和水解阶段设计单因素试验，用高效液相色谱法进行含量测定，确定超声提取最优条件，结果显示超声提取效率高于回流提取。

1 材料与试剂

高效液相色谱仪(安捷伦1290 Infinity，岛津)；高速冷冻离心机(塞默飞世尔科技有限公司，Multifuge X3R)；智能型液晶数控型超声波清洗机(威固特新型设备有限公司，型号：KM-1990QFY)；200克手提式高速万能粉碎机(温岭市林大机械有限公司，型号：DFT-200)；电子分析天平(SARTORIUS赛多利斯经济型精密天平GL2202-1SCN)。

甲醇为色谱纯，超纯水，无水乙醇、磷酸、盐酸、甲酸乙酯、甲苯等均为分析纯，槲皮素(中国药品生物制品检定所，批号：100081-201506)，梧州桑寄生茶(产地：梧州)。

2 方法

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备

称取槲皮素对照品适量，共6份，分别置于25 mL容量瓶中，分别加入甲醇稀释，微孔滤膜过滤，然后加甲醇至刻度，使之浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL。

2.1.2 供试品溶液的制备

称取恒重的寄生茶浸膏30 mg置于具塞锥形瓶中，加入70%乙醇溶液10 mL，超声溶解浸膏，用70%的乙醇补足在超声过程中减失的重量，再加入盐酸溶液2mL，置于90℃的水浴上加热1 h，将溶液转移至25 mL容量瓶中，加入70%乙醇定容至刻度，即得供试品溶液。

2.2 槲皮素分析方法的建立

2.2.1 色谱条件[4]

色谱柱C18填充材料柱Thermo Accucore(2.6μm，100 mm×2.1 mm)，甲醇、0.2%磷酸溶液(40：60)为流动相，流速为0.3 mL/min，柱温箱35℃，进样量2μL，紫外检测波长360 nm。

2.2.2 标准曲线的制备

分别精密称取槲皮素标准品(0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12 mg/mL)2 μL，按步骤“2.2.1”色谱条件进样，以槲皮素标准品质量为横坐标X(μg)，峰面积为纵坐标Y(mAU)，得到线性方程为Y=170.9X+0.1081，R2=0.9995。结果表明，槲皮素在0.04～0.24μg进样范围内呈良好的线性关系。线性关系见图1。

2.2.3 分析误差校验

分别按照精密度试验、待测液稳定性试验、重复性试验、加样回收试验要求进行分析误差校验，结果见下页表1。

表1 分析误差校验结果

验证方法精密度试验稳定性试验重复性试验加样回收试验RSD(%)1.42.02.11.6平均回收率(%)99.37

2.3 超声辅助法提取槲皮素工艺优化

2.3.1 提取阶段优化

超声辅助提取法是应用超声波辅助溶剂进行提取，声波产生高速、强烈的空化效应和搅拌作用，破坏植物药材的细胞，使溶剂渗透到药材细胞中，缩短提取时间，提高提取率。频率、溶剂、时间、料液比和提取温度是影响超声辅助提取的重要因素，由于声波频率对提取的影响无法测定，因此，对溶剂，时间，料液比和提取温度进行单因素试验，因素水平见表2。

表2 提取阶段单因素试验因素和水平

水平因素温度(℃)A乙醇体积分数(%)B时间(min)C料液比D12050201:1024070301:2036090401:30

2.3.2 水解阶段优化

水解过程采用盐酸进行，盐酸相对于硫酸对仪器的损害较小。水解温度、水解时间、加酸量对水解都有影响，从而影响提取物的含量。对水解温度、水解时间、加酸量三个条件进行单因素实验，因素水平见表3。

表3 水解阶段单因素实验因素和水平

水平因素水解温度(℃)A0水解时间(min)B0加酸量(mL)C0150300.50270601.00390901.50

2.4 样品测定

取3个批次的梧州寄生茶，每个批次分别用超声辅助法最优工艺和回流法提取1次，比较槲皮素得率。

3 结果与分析

3.1 超声辅助法提取槲皮素工艺优化结果

3.1.1 提取阶段优化结果

取粉碎、筛分(过2号筛和4号筛)后的寄生茶粉末10.0 g，按表2的水平进行单因素试验，样品按步骤“2.2.1”色谱条件进样，结果见表4。

表4 提取阶段单因素实验结果

实验号温度(℃)A乙醇体积分数(%)B时间(min)C料液比D含量(%)12050201:200.078924050201:200.108136050201:200.156446050201:200.154256070201:200.246366090201:200.073176050201:200.151986050301:200.185496050401:200.2041106050201:100.1768116050201:200.1549126050201:300.0953

由表4提取阶段单因素试验数据可知，不同提取温度含量由高到低排列依次是A3>A2>A1，乙醇不同体积分数含量由高到低排列依次是B2>B1>B3，不同提取时间含量由高到低排列依次是C3>C2>C1，不同料液比含量由高到低排列依次是D1>D2>D3。综合考虑，超声辅助提取的最优方案为：A3B2C3D1，即提取温度为60℃、乙醇体积分数为70%、提取时间为40min、料液比为1∶10。

3.1.2 水解阶段优化结果

按照最佳提取条件：温度60℃、乙醇体积分数70%、提取时间40 min、料液比1∶10，进行超声提取，提取物按表3的因素水平进行单因素试验，结果见表5。

表5 水解阶段单因素实验结果

实验号水解温度(℃)A0水解时间(min)B0加酸量(mL)C0含量(%)150601.000.2370270601.000.2669390601.000.2827490301.000.2968590601.000.2886690901.000.2795790600.500.2925890601.000.2810990601.500.2738

由表5水解阶段单因素实验数据可知，不同水解温度含量由高到低排列依次是A03>A02>A01，不同水解时间含量由高到低排列依次是B01>B02>B03，不同加酸量含量由高到低排列依次是C01>C02>C03。综合考虑，水解阶段最优方法为：A03B01C01，即水解温度为90℃、水解时间为30 min、加酸量为0.5 mL。

3.1.3 方法验证

分别取粉碎、筛分(过2号筛和4号筛)后的寄生茶粉末6份，每份10.0 g，按优化的提取工艺(A3B2C3D1)、水解方法(A03B01C01)制备供试品溶液，按步骤“2.2.1”的色谱条件进样，测定槲皮素的含量。结果6个样品槲皮素的含量比较均一，平均值为0.3112%。重现性试验RSD为1.8%，稳定性试验RSD为0.7%，回收试验RSD为0.6%，说明超声辅助法提取槲皮素方法可行，且获得的槲皮素24h 内稳定。

3.2 样品测定结果

取梧州桑寄生茶三个批次，每批次2份，每份约10.0 g。每批次的1份按照优化后的超声辅助法进行提取和水解，另1份按药典的回流法进行提取，样品按步骤“2.2.1”色谱条件进样，结果见表6。

表6 不同批号样品测定结果

批号123平均超声辅助提取槲皮素含量(%)0.3240.2900.2820.298回流提取槲皮素含量(%)0.2310.2080.2170.218

4 结论

采用超声辅助法提取梧州桑寄生中的槲皮素平均值为0.298%，采用回流法提取梧州桑寄生中的槲皮素平均值为0.218%，且超声辅助提取具有提取率高、用时短和防止有效成分热分解等优势，所以提取梧州桑寄生中的槲皮素，超声辅助提取法优于回流法。