唐古特大黄种子质量研究

黄凤，唐国琳，洪容容，李卫东，蒋桂华

大黄为中医临床常用大宗药材，具有清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄的功效[1]。唐古特大黄Rheum tanguticumMaxim.ex Balf.是中药大黄基原之一，主要以种子繁殖。近年来，野生的唐古特大黄资源蕴藏量在急剧下降[2-3]，栽培唐古特大黄替代野生唐古特大黄成为其药材来源是保证其资源可持续利用的有效途径。唐古特大黄的种植在甘肃、四川等地已渐成规模，然而一些地区的管理仍较为粗放，种质质量参差不齐，甚至出现混杂现象[4]。因此，有必要对唐古特大黄种子质量进行研究，制定可行的评价指标及分级标准，确保栽培唐古特大黄药材质量。

1 材料

1.1 样品来源

在唐古特大黄主产地共收集了13批种子，经成都中医药大学蒋桂华教授鉴定为蓼科唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.的种子，具体信息如表1。

表1 13批唐古特大黄种子来源

3 四川省白玉野生 BYY1 阴干4 四川省白玉野生 BYY2 阴干5 四川省白玉野生 BYY3 阴干6 四川省白玉野生 BYY4 阴干7 甘肃省甘南栽培 GNZ 阴干8 四川省黑水栽培 HSZ 3年 阴干9 四川省茂县栽培 MXZ1 3年 阴干10 四川省茂县栽培 MXZ2 2年 阴干11 四川省茂县栽培 MXZ3 2年 阴干12 四川省石渠野生 SQY 阴干13 四川省小金野生 XJY 阴干

1.2 仪器与试剂

LKTC-BI-T数显电子恒温水浴锅（国华电器有限公司）、GTOP系列智能光照培养箱（浙江托普仪器有限公司）、DZG-6090真空干燥箱（上海森信实验仪器有限公司BP121S电子天平）、Sartorlus00000792-1精密电子天平（盛博电子衡器有限公司）；0.1%四唑溶液、红墨水、蒸馏水。

2 方法

2.1 唐古特大黄种子性状检测

随机从种子中选取20粒大黄种子用游标卡尺测量并记录其长（果实顶端至基部），宽（果实横切面两果翅翅缘最大距离），20组长、宽的平均值即视为该产地种子的长度和宽度（精确到0.1mm）。

2.2 唐古特大黄种子净度

用四分法从袋装种子中选取30g-35g（至少2500粒种子），用镊子挑取种子，按照健粒、废粒（小于半粒）、杂质及其他植物种子划分，最后以健粒克数占总实验种子克数（精确到0.1g）算百分比。

2.3 唐古特大黄种子千粒重测定

选取净种子2000粒，分两组各1000粒称重（精确到0.1g），两组之间千粒重差值与平均数之比不超过5%则视为合格，超过则称量第三份，取3份中差距最小的两份作为该产地千粒重。在种子含水的情况下，不同产地的种子含水量不同，直接测千粒重不具代表性。所以应使用种子绝对千粒重来衡量种子真实情况，绝对千粒重是种子在含水量为0的情况下测量的千粒重。计算公式为：

种子绝对千粒重=种子千粒重×（1-试样含水量）

2.4 唐古特大黄种子水分测定

每个产地选取净种子每组4g-4.5g，进行两组平行，放入已经过恒重3h并称重的称量瓶内，放置种子厚度为10-15mm，加盖用电子天平称量（精确到0.0001g）后放入已预热的烘箱内（开盖），以105℃的温度连续恒重8h，取出盖盖放入干燥器内放凉30min，称重计算两组差值。两组差值不得超过0.2%，否则重做两组实验，直到合格为止。种子水分计算公式为：

种子水分=（烘前试样重量-烘后试样重量）/烘前试样重量×100%

2.5 唐古特大黄种子生活力测定

种子生活里采用四唑（TTC）染色法测定：每个产地取净种子300粒，分两组每组100粒用纱布包裹放入装有蒸馏水的烧杯内，用水浴锅恒温20℃，浸24h。称取氯代三苯基四氮唑（红四氮唑）1g配1000ml蒸馏水摇匀备用。

切种：将泡好的种子用刀片沿着种脊切开，选取含胚较大一半进行染色实验。

染色：将切好的种子放入盛有四唑溶液的培养皿里，在30-35℃的黑暗环境中浸泡4h，后用镊子挑选出胚被染色的半粒。胚被染成红色着则有生活力，反之则无生活力。生活力计算公式为：生活力=被染种子数/100×100%，若两组实验生活力差值超过5%则需进行第三组实验直到达到差值要求，取两组间差值最小的平均值作该产地生活力。

2.6 唐古特大黄种子发芽率测定

从净种中选取300粒用纱布包裹放入装有蒸馏水的烧杯在水浴锅中恒温放置24h。

本实验选用纸上（TP）发芽法，培养皿（10cm）在使用前需经沸水杀毒，减少微生物滋生而影响发芽效果；选用三层中速滤纸加以蒸馏水润湿（滤纸润湿后倾斜可滴一滴水为宜）；从300粒已浸种中选取200粒分四组每组50粒，按一定密度置于滤纸上，盖盖置于恒温20℃亮（12h）暗（12h）交替的培养箱中。每日定时观察发芽情况记录发芽数并通气加蒸馏水。发芽率的计数方式为：以首次胚根从种皮中伸出为初次计数时间，以发芽后种子连续三天再无发芽情况为末次计数时。依据本实验实际唐古特大黄种子的初次计数时间为第2天，末次计数时间为第9天。四组4发芽率在容许误差内则其平均发芽率为该产地发芽率，否者重新进行一组实验。

发芽率的计算公式为：发芽率=末次计数发芽数/试样种子数×100%

平均发芽率=4组发芽率总和/4×100%

2.7 唐古特大黄种子发芽势测定

种子在规定时间内开始萌发的正常种子数目占供试种子的百分比即为发芽势。发芽势的计算公式为：发芽势=初次计数正常幼苗数/试样种子数

2.8 相关性分析

采用spss21.0统计分析软件person相关性分析，研究水分、千粒重、生活力、发芽率、发芽势之间的相关性。

2.9 唐古特大黄种子分级研究

在进行相关性分析的基础上，采用K-均值聚类法对差异显著且能直接影响唐古特大黄种子质量的指标作为种子质量分级的指标，初步进行聚类分级。

3 结果

3.1 性状检测结果

13批唐古特大黄种子的外观形态大体一致，矩椭圆形或长椭圆形，大部分为三翅，少部分具两翅或四翅，颜色大多为棕褐色，少数为淡紫色或淡褐色，果实基部常留存三裂花萼，具果柄，具长短不一的果脐，果皮较厚且其表面光滑无毛，果实内部仅有一颗种子。测量结果如表2。

表2 13批唐古特大黄种子长度、宽度测定（n=20）

3.2 净度分析结果

如表3所示，本次实验13批唐古特大黄种子净度在84.52%～98.06%之间，其中黑水栽培最高为98.06%，白玉野生4号最低为84.52%。

3.3 千粒重测定结果

唐古特大黄种子千粒重波动较大，如表3所示，本次试验13批唐古特大黄种子千粒重范围在7.31g～12.76g之间，其中最高为白玉野生12.76g，最低为白玉栽培2号7.31g。

3.4 水分测定结果

13批唐古特大黄种子水分含量较为稳定，如表3可知，其范围在9.07%～9.99%之间，最高为白玉栽培2号9.99%，最低为茂县栽培3号。

表3 13批唐古特大黄种子净度、千粒重、水分测量结果

3.5 生活力测定结果

13批唐古特大黄种子生活力在23.00%～99.50%之间（表4），其中最高的为甘南栽培种子，达99.5%，最低为小金野生种子，仅为23.0%。

3.6 发芽率、发芽势测定结果

由表4测定结果可知，13批唐古特大黄种子的发芽率在6.0%～99.5%之间，发芽势在0.5%～59%之间。由实验记录得唐古特大黄种子普遍在置种后第2天伸出胚根，置种后第3天种子发芽达到旺盛时期，第5天子叶从种皮中脱出。

表4 13批唐古特大黄种子生活力、发芽率、发芽势测量结果

3.7 相关性分析结果

由分析结果可知，千粒重、水分与生活力及发芽率相关性不大，而生活力与发芽率成极显著正相关（如表5所示）。

表5 13批唐古特大黄种子6项指标相关性分析结果

**. 在0.01 水平（双侧）上显著相关。

3.8 种子质量分级结果

根据测定结果及相关性分析，将唐古特大黄净度、千粒重、生活力作为分级指标，设定3个分类等级。方差分析表明，唐古特大黄种子净度、千粒重在四个类别中呈现显著差异，说明对种子分级起作用的为净度及发芽率。由于考虑到千粒重是种子本身的差异，在制定唐古特大黄种子等级质量标准时仍作为指标。根据聚类分析结果（见表6 ），13批唐古特大黄种子初步分为3级。1、2级种子为合格种子，需同时满足三个质量指标；不符合1、2级标准的即为三级种子，为不合格种子；13批唐古特大黄种子合格率为84.61%。

表6 唐古特大黄种子分级标准

4 讨论

本实验考察了唐古特大黄种子浸种温度（20℃、25℃、30℃）及发芽温度（20℃、25℃），最终得到其发芽实验适宜浸种温度为20℃浸种12h。由于发芽温度20℃与25℃无明显差异，本次实验选用发芽温度为20℃。对四唑染色与红墨水染色效果进行了对比，结果显示四唑染色法较红墨水染色法更能直观准确判断大黄种子胚是否被染色，因此本实验采用四唑染色法结果用以分析13批唐古特大黄种子生活力。

就本实验13批唐古特大黄种子K-聚类分析结果来看，同一产地的栽培唐古特大黄种子与野生唐古特大黄种子质量差异较大，且野生种子质量波动较大，这可能与野生大黄生长粗放及野生采种无法判断生长年限有关。本实验结果显示，不同产地栽培唐古特大黄种子质量皆呈现出两年生种子不及三年生，据文献可知，唐古特大黄种子一般在移栽后第二年采可进行采种[5-6]，但本实验结果表明，两年生种子仍具有一定的利用价值。