HPLC同时测定宽叶羌活药材中5种成分含量

唐国琳 ，黄凤，高天元，吴情梅，喻文，邱慧，蒋桂华

宽叶羌活Notopterygium franchetiiH. de Boiss.为伞形科羌活属多年生草本植物，俗称黑药，药用部位主要为其干燥根茎及根[1]，主要分布在四川西北部、青海、甘肃、西藏东部等高原地区[2]。在临床上常用于治疗风寒感冒、头痛、风湿痹痛等症[3-4]。现代研究表明宽叶羌活药材具有抗炎、镇痛解热、抗心律失常、抗心肌缺血和抗菌等作用[4]。挥发油、香豆素类、有机酸类化合物是宽叶羌活中最主要的三大类活性成分[5]。研究发现阿魏酸具有抗炎、抗氧化、抗辐射和抗肿瘤等作用[6-9]；羌活醇和异欧前胡素具有镇痛、舒张血管[10]、抗病毒活性[11]作用；紫花前胡苷有镇痛[12]、抗炎[13]、改善学习记忆[14]等作用；佛手柑内酯有抗衰老、抗肿瘤等作用[15-17]。

关于宽叶羌活药材的成分含量测定已有许多报道，但只是测定其中的2或3种成分[18-20]，如高建邦等人同时测定了异欧前胡素和阿魏酸的含量。目前中国药典2015年版一部主要以羌活醇和异欧前胡素的含量之和控制宽叶羌活药材的质量。众所周知中药的多效性源于其复杂的化学成分，仅靠一两个成分的含量测定不能反映其他成分的情况，难以真正控制其质量。选择上述5 种成分作为指标进行质量控制研究，更能合理、全面评价宽叶羌活药材质量。因此本实验拟建立同时测定上述5种成分的高效液相色谱法，并对不同批次宽叶羌活药材进行含量测定，为更进一步全面评价宽叶羌活药材质量提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）、KQ5200E型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）、SQP型电子分析天平（万分之一赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）。

1.2 试药

有机溶剂包括甲醇（分析纯）、冰醋酸（成都市科隆化学品有限公司）；色谱乙腈（成都市科隆化学品有限公司）；纯净水。对照品阿魏酸、佛手柑内酯、紫花前胡苷、羌活醇、异欧前胡素均购自于成都曼斯特生物科技有限公司，各对照品纯度都达99%及其以上。

样品分别来自四川白玉县、小金县；青海祁连县、班玛县；甘肃宕昌县；共计13批。经成都中医药大学蒋桂华教授鉴定均为伞形科植物宽叶羌活Notopterygium franchetiiH. de Boiss.的干燥根及根茎。

表1 不同批次宽叶羌活药材样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

GL Sciences Wondasil C18色谱柱（4.6mm×250 mm，5μm）；乙腈（B）-0.3%醋酸水（A）为流动相；流速1 mL﹒min-1；梯度洗脱（0～14min，15%～35%B；14～20min，35%B；20～35min，35%～60%B；35～40min，60%～75%B；40～42min，75%～15%B；42～50min，15%B）；柱温25℃；检测波长为315 nm；进样量10μL。对照品及样品的高效液相色谱图见图1。

2.2 对照品溶液的制备

取对照品紫花前胡苷、阿魏酸、佛手柑内酯、羌活醇、异欧前胡素各适量，精密称定，以甲醇溶解，摇匀并定容，制成含紫花前胡苷（239.00μg﹒mL-1、阿魏酸 （174.00μg﹒mL-1）、佛手柑内酯（237.00μg﹒mL-1）、羌活醇 （270.00μg﹒mL-1） 和异欧前胡素（217.00μg﹒mL-1） 的混合对照品贮备液。

2.3 供试品溶液的制备

参考《中国药典》2015年版并结合文献[20、22]，选择以下提取条件：取宽叶羌活粉末（过三号筛）约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定其质量，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

图 1 对照品（A）及宽叶羌活药材样品（B）HPLC图

2.4 线性关系考察

分别精密吸取混合对照品溶液4，8，12，16，20 μL按2.1项下色谱条件进行分析，测定峰面积。以对照品峰面积为纵坐标（Y），以对照品进样量X（μg）为横坐标，得线性回归方程，结果见表2。

表2 5个成分的线性回归方程、相关系数和线性范围

2.5 精密度试验

取同一宽叶羌活药材（3号）样品约0.3 g，精密称定，用2.3项下的制样方法制备样品，在同一色谱条件下连续进样6次，进样体积均为10μL，记录5个成分的色谱峰面积。结果紫花前胡苷、阿魏酸、佛手柑内酯、羌活醇、异欧前胡素峰面积RSD分别是1.87%，0.71%，0.53%， 1.89%，1.87%。表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一宽叶羌活药材（3号）样品约0.3 g，精密称定，用2.3项下方法制备1份样品，在同一色谱条件下，分别在0，2，4，8，16，24 h进样，分别计算5种成分峰面积的RSD。结果紫花前胡苷、阿魏酸、佛手柑内酯、羌活醇、异欧前胡素峰面积RSD分别是0.84%，1.59%，1.11%， 1.77%，1.24%。表明供试品溶液24h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

分别称取6份同一宽叶羌活药材（3号）样品，各约0.3 g，精密称定，按2.3项下方法制样，并进行测定。结果表明，紫花前胡苷、阿魏酸、佛手柑内酯、羌活醇、异欧前胡素6次测定值的RSD分别为2.57%，2.56%，1.83%， 2.98%，1.17%。表明方法的重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取同一宽叶羌活药材（3号）样品0.1 g，精密称定，取混合对照溶液2 ml，用甲醇定容至25 ml，得紫花前胡苷、阿魏酸、佛手柑内酯、羌活醇、异欧前胡素浓度分别为19.20 mg﹒L-1、13.98 mg﹒L-1、19.00 mg﹒L-1、21.6 mg﹒L-1、17.4 mg﹒L-1的新混合对照品溶液，分别取0.5、1.0、2.0 ml作为加标溶液，每个浓度平行3次。按2.3项下的方法制样，按2.1项下色谱条件进样分析，计算回收率，结果见下表3。

表3 加样回收率试验（n=3）

0.0192 1.6407 97.39 0.0384 1.6608 101.04阿魏酸 0.587 0.0070 0.5938 97.14 98.08 0.97 0.0140 0.6008 98.57 0.0280 0.6147 98.93佛手柑内酯 2.099 0.0095 2.1081 95.80 97.37 1.62 0.0190 2.1178 98.95 0.0380 2.1360 97.37羌活醇 1.889 0.0108 1.8997 99.07 100.54 1.39 0.0216 1.9110 101.85 0.0432 1.9352 100.69异欧前胡素 1.495 0.0087 1.5040 103.45 102.59 0.74 0.0174 1.5128 102.3 0.0348 1.5305 102.01

2.9 样品测定

取不同批次的宽叶羌活样品各0.3 g，精密称定，按2.3项下方法制备供试液，按照2.1项下色谱条件注入液相色谱仪，每批平行测定2次，记录峰面积，用标准曲线计算出含量。结果见表4。

表4 不同批次宽叶羌活样品中主要成分的比较（n=2）（mg﹒g-1）

从表4可以看出：不同产地的宽叶羌活药材，各成分的含量变化范围较大。整体来说，宽叶羌活栽培品的异欧前胡素含量较之野生品高，野生品的羌活醇、紫花前胡苷含量较之栽培品高，与文献报道一致[21]。关于栽培品与野生品中羌活醇与异欧前胡素的具体关系，有待进一步研究。

不同产地各成分含量差异很大，可能与采收时间有关。青海的羌活与其它产地产的紫花前胡苷含量差异巨大，其原因值得进一步探讨。

3 讨论

3.1 提取溶剂和提取方法的选择

本实验比较了甲醇（25 ml、50 ml）、乙醇、甲醇水（80%）、乙醇水（75%）四种溶剂。提取方法比较了超声提取和加热回流以及不同提取时间（30 min、45 min、60 min）。水提取使样品中香豆素类峰面积降低，且明显低于醇提样品所得峰面积；甲醇提取时总色谱峰面积大于乙醇提取得到的总峰面积；超声提取易操作。故最终提取溶剂和方法为：加甲醇25 ml超声30 min。

3.2 测定波长的确定

采用二极管阵列检测器，对5个被测成分进行190～400 nm 全波长扫描，图谱结果显示在315 nm处均有较大吸收，出峰数量多，故选315 nm作为检测波长。

3.3 色谱条件优化

对常用流动相（甲醇-水、乙腈-水、 甲醇-0.3%醋酸水、乙腈-0.3%醋酸水）及流动相梯度分别进行了考察，结果表明乙腈-0.3%醋酸水、梯度洗脱效果好。并在此基础上考察了柱温（25 ℃、30 ℃）和体积流量（0.8、1 ml/min）对分离效果的影响，柱温25 ℃，体积流量0. 8 mL/min时分离效果好。