石首地区野生麋鹿自然保护区重要病原菌(虫)调查

王明月周东海* 郭定宗温华军李鹏飞郭 锐常 优方 瑞

(1.华中农业大学，武汉，430070；2.石首麋鹿国家级自然保护区管理处，石首，434407；3.湖北省农业科学院，武汉，430064)

麋鹿(Elaphurusdavidianus)原为中国独有的物种，距今已有300万年的历史。历史上的麋鹿有5个种，现只有达氏种生存至今，其他物种均已灭绝[1-2]。1900年八国联军攻入北京，南海子麋鹿被西方列强掠夺一空，麋鹿在中国国土上基本灭绝。新中国成立后，中国政府希望能使麋鹿重回中国故乡，但由于繁殖障碍，最初被引进的2只麋鹿一直未能顺利繁殖。1985年北京麋鹿生态实验中心从英国乌邦寺引进麋鹿38头，使得麋鹿重回故乡[3]。现阶段麋鹿为中国国家Ⅰ级保护野生动物。发展至今，中国已拥有江苏大丰野生麋鹿群、湖北石首野生麋鹿群和洞庭湖野生麋鹿群3大野生麋鹿种群[1]。

经过多年的努力，野生麋鹿种群得到了快速的增长。但由于野生麋鹿生存环境的特殊性和麋鹿本身的生物学特性，使得在野生麋鹿疾病的治疗和管理上困难重重。2010～2011年，石首麋鹿自然保护区野生麋鹿大量死亡。由于当时麋鹿数量多达700余头，超过保护区存载量，环境自然降解能力降低，剧烈的天气变化等客观因素和保护区缺乏防疫基础设施、定期的疫病监测和有效的监测手段等主观因素共同影响，使得麋鹿大规模暴发疫病[4]。麋鹿作为珍稀动物，对它保护所带来环境生态效益是难以估量的，其对生物多样性保护意义远远超过单一物种的生存和繁衍问题。对麋鹿及其自然栖息地的保护促进了整个生态系统的保护，推动了中国野生动物保护事业的发展。麋鹿作为重要的可再生保护资源，是极具经济价值的动物。本文通过调查石首麋鹿自然保护区内重要病原菌和寄生虫的感染情况，对于建立完善的疫病防控体系，保护区进行合理科学的管理规划具有重要的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料

2016年8月采集的麋鹿粪便11份。

2016年8月采集的病死麋鹿脏器：包含肺脏、肾脏、肝脏、脾脏、肠管等。

2016年12月采集的麋鹿粪便12份。

(本试验所使用的病料均由湖北石首野生麋鹿自然保护区工作人员提供)。

1.1.2 试验药品及仪器

光学显微镜；显微摄影成像系统；PCR仪；电脑三恒多用电泳仪；超净工作台；电热恒温培养箱；高级凝胶成像系统。

TSA培养基；SS培养基；EMS培养基；MAC培养基；厌气肉肝汤；营养肉汤；Mueller-Hinton琼脂；脱脂绵羊血(以上试剂均购自青岛海博生物技术有限公司)；16S rRNA上下游引物；PCR Mix(以上试剂均购自武汉擎科生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离纯化及形态学观察

无菌条件下，将粪便样品接种于TSA培养基上，37℃培养18 h，挑取不同菌落分别接种于TSA培养基、SS培养基、MAC培养基和EMS培养基上并编号，37℃培养18 h。无菌条件下，切开脏器，用接种环刮取脏器内表面渗出液，分别接种于鲜血平板和TSA培养基上，37℃培养18 h，观察菌落的生长情况及细菌的溶血情况。挑取不同菌落分别接种于TSA培养基、SS培养基、MAC培养基和EMS培养基上并编号，37℃培养18 h。

观察菌落形态和特点，挑取不同的单菌落，革兰氏染色镜检，观察显微镜下细菌形态。记录形态，采集图像。挑取单菌落，接于NB肉汤中，摇床中富集18 h。

1.2.2 分离菌株的16S rRNA PCR鉴定

PCR检测：于PCR管中加入无菌蒸馏水9 μL，Mix 12 μL，16S-f1 μL，16S-r1 μL，培养18 h的菌液2 μL，制成25 μL反应系统，混匀，振荡，离心。

PCR扩增条：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s、55 ℃退火60 s、72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。取4 μL的PCR反应产物，用1%的琼脂糖凝胶(每100 mL 1%的TAE加入5 μL的EB)电泳，电压160 V，置于凝集成像系统下拍照。

PCR测序：将电泳跑出明显条带的菌液送至武汉擎科创新生物有限公司进行测序。

1.2.3 寄生虫检查方法

1.2.3.1 饱和食盐水浮聚法

取少量粪便和适量饱和食盐水于研钵中研磨后，置于5 mL一次性玻璃瓶中，慢慢往瓶中加入饱和食盐水，直至液面为凸液面而不溢出，在瓶口覆盖一载玻片，静止15 min后，将载玻片提起并迅速翻转，盖上盖玻片，镜检。

1.2.3.2 沉淀集卵法

取10 g粪便于研钵中，加入少量清水充分研磨，经80目金属分样筛过滤至50 mL烧杯中，加入清水至杯口，静止15 min，倒去上清，重新加满水，静置15 min，如此重复3次，最后倒去上清液，用滴管吸取底层沉渣滴于载玻片上，盖上盖玻片，镜检。

2 实验结果

2.1 细菌分离结果

2.1.1 细菌形态

从采集的粪便样品和病死麋鹿脏器中共分到8类菌，其在营养琼脂的生长情况和革兰氏染色结果如下。

嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)在TSA培养基上生成圆形菌落，边缘光滑，灰白色菌落；显微镜下观察到的结果，革兰阴性菌，菌体呈短杆状(图1，左图)。志贺杆菌(Shigabacillus)在TSA培养基上为透明、圆形的小菌，在MAC上为无色菌落，显微镜下观察到的结果，革兰阴性菌，直杆菌(图1，右图)。

图1 嗜水气单胞菌(左图)；志贺杆菌(右图)Fig.1 Aeromonas hydrophila(left)；Shigella(right)

图2 蜡样芽孢杆菌(左图)；大肠杆菌(右图)Fig.2 Bacillus cereus(left)；Escherichia coli(right)

蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)在TSA培养基上形成近似圆形的白色有光泽菌落，在血琼脂培养基上为边缘不整齐的毛玻璃状灰白色菌落；显微镜下观察到的结果，革兰氏阳性杆菌，菌体细胞杆状，末端方(图2，左图)。大肠杆菌(Escherichiacoli)在TSA上为光滑湿润半透明菌落，EMS上生成黑色有金属光泽的菌落，MAC上为粉红色菌落；显微镜下观察到的结果，革兰氏阴性短杆菌(图2，右图)。

图3 链球菌(左图)；粪肠球菌(右图)Fig.3 Streptococcus(left)；Enterococcus faecalis(right)

链球菌(Streptococcus)在TSA上不生长，在鲜血培养基上形成透明溶血现象，生长良好；显微镜下观察到的结果，革兰氏染色阳性，球形或卵圆形，呈链状排列(图3，左图)。粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)在TSA培养基上生成半透明、湿润的小菌落；显微镜下观察到的结果，革兰氏染色阳性，卵圆形菌(图3，右图)。

图4 产气荚膜梭菌(左图)；乳酸杆菌(右图)Fig.4 Clostridium perfringens(left)；Lactobacillus(right)

产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)在厌气肉肝汤液体培养基中，产生气体；显微镜下观察到的结果，革兰氏染色阳性，大肠杆菌，两头钝圆，菌体卵圆形(图4，左图)。乳酸杆菌(Lactobacillus)在TSA培养基上形成白色不透明小菌落，边缘不光滑，生长良好；显微镜下观察到的结果，革兰氏颜色阳性，菌体杆状，单个或呈短链存在(图4，右图)。

2.1.2 PCR测序结果

如图5所示，4、6、7、11泳道为大肠杆菌电泳结果，5泳道为嗜水气单胞菌电泳结果，10泳道为粪肠球菌电泳结果，12泳道为蜡样芽孢杆菌电泳结果，15泳道为志贺杆菌电泳结果。

将PCR产物送检测序，结果与NCBI参考菌种16S rRNA基因核酸序列进行同源性分析比较，得出乳酸杆菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、嗜水气单胞菌、粪肠球菌、志贺杆菌和链球菌的

核苷酸序列同源性均在97%～100%之间。结合菌株镜检形态和生长特性，从而确定分离得到纯培养菌株的种属。

图5 PCR产物电泳结果Fig.5 Electrophoretic results of PCR products

2.2 寄生虫鉴定结果

在2016年8月收集的11份样品中，共检测到3种虫卵。

血矛线虫(Haemonchuscontortus)卵，呈椭圆形，平均大小70 μm×50 μm，卵壳光滑且薄，卵内含8～10个胚细胞(图6，A图)，检出率为1/11。前后盘吸虫(Paramphistomum)卵，呈椭圆形，平均大小125 μm×90 μm，浅灰色，卵黄未充满整个虫卵(图6，B图)，检出率为2/11。贝氏莫尼茨绦虫(Monieziabenedeni)卵，呈不规则四角形，平均大小40 μm×55 μm卵内有特殊的梨形器，器内含六钩蚴(图6，C图)，检出率为1/11。

在2016年12月收集的11份样品中，未检测到虫卵。

图6 A图，血矛线虫卵(卵圆形，小于100 μm)；B图，前后盘吸虫卵(卵圆形，大于100 μm)；C图，贝氏莫尼茨绦虫卵(不规则四角形，小于100 μm)Fig.6 A，Haemonchus contortus egg(oval，less than 100 μm)；B，Paramphistomum egg(oval，more than 100 μm)；C，Moniezia benedeni egg(irregular quadrangle，less than 100 μm)

3 讨论

3.1 病原菌结果讨论

本研究通过对2016年8月和2016年12月的两批样本进行病原菌分离鉴定，得到大肠杆菌、嗜水气单胞菌、志贺杆菌、蜡样芽孢杆菌、链球菌、粪肠球菌、产气荚膜梭菌和乳酸杆菌8种细菌，其中粪肠球菌、乳酸杆菌和大肠杆菌为正常存在于肠道的菌种，且乳酸杆菌为益生菌，而大肠杆菌为机会致病菌。嗜水气单胞菌广泛存在于水源和水生动物体内，是一种条件致病菌，在条件合适的情况下会产生外毒素，如溶血素、肠毒素等，对麋鹿的健康存在一定的威胁[5]。

在病死麋鹿病料中分离得到的志贺杆菌、蜡样芽孢杆菌、产气荚膜梭菌和链球菌均能导致麋鹿生病甚至死亡。蜡样芽孢杆菌广泛存在于麋鹿生活地区的水域和土壤中，同样可存在于麋鹿食用的食物中和麋鹿的肠道内，其产生的肠毒素，可引起麋鹿的中毒性腹泻。产气荚膜梭菌是一类革兰氏阳性菌，可存在于麋鹿可饲食物中和水体中，主要导致动物肠毒血症，张林源等[6]研究中曾报道该菌引起麋鹿大量死亡的事实。链球菌主要通过飞沫传播，在麋鹿病料中分离到的链球菌为溶血性链球菌，此类链球菌致病力强，引起动物的肺炎、肾炎、败血症等疾病，对麋鹿的健康存在严重的威胁。志贺杆菌又称痢疾杆菌，通过食物和水源传播，夏秋季感染性较高，可引起动物机体腹泻。

3.2 寄生虫结果讨论

2016年8月麋鹿粪便寄生虫卵检测阳性率为23.3%(3/11)，而2016年12月麋鹿粪便样本均未检出寄生虫卵。两批样本结果的差异，可能是由于季节因素导致的。湖北石首麋鹿自然保护区位于N29°25′，E112°14′，属亚热带季风气候，年平均气温为15.9℃～16.6℃[7]。8月正值夏季，降雨量大，平均气温高，环境条件适合寄生虫传播和繁殖。而12月正值冬季，气温相对较低，寄生虫存活率低，所以麋鹿感染寄生虫的概率有很大程度的降低。

此次调查检测出的肠道寄生虫虫卵主要为前后盘吸虫卵、贝氏莫尼茨绦虫卵和血矛线虫卵。由于麋鹿擅长游泳，且石首位于湿地生态系统，区内分布多种淡水螺，为吸虫的传播提供了大量中间宿主，所以石首地区的麋鹿吸虫的检出率相对于其他地区较高[8]。贝氏莫尼茨绦虫在绵羊体内的检出率较高[9]，而关于鹿科动物，该虫寄生的相关报道较少。血矛线虫寄生于反刍动物皱胃，在野生反刍动物中检出的报道较多，在鹿科动物寄生虫调查中也曾报道[10]。

3.3 疫病防控体系建立讨论

根据此次调查结果，现提出以下疫病防控建议：

建议保护区内工作人员对麋鹿活动地区水体、土壤进行定期消毒，适当选择消毒液种类；注重疫病防控，安排人员定期统计保护区内麋鹿发病率和死亡率；于保护区工作站配备专业的兽医，能在疫病发生第一时间做出准确诊断，并能提出针对性的治疗方案；针对麋鹿地区存在的重要致病菌和寄生虫，配备相应敏感抗生素和驱虫药物，对发病动物进行人工干预治疗；对死亡麋鹿，合理地进行无害化处理。

[1] 丁玉华，任义军，温华军，等.中国野生麋鹿种群的恢复与保护研究[J].野生动物学报，2014，35(2)：228-233.

[2] 丁玉华.中国麋鹿研究[M].吉林：吉林科学技术出版社，2004.

[3] 新华网.麋鹿回归20年：命运多舛话麋鹿[EB/OL].(2005-08-25).http：//news.sina.com.cn/s/2005-08-25/18386782089s.shtml.

[4] 钟震宇，李鹏飞.湖北石首麋鹿保护区麋鹿疫病防控体系建设探讨[J].养殖与饲料，2016(10)：19-22.

[5] 于学辉，王远微，汤承，等.嗜水气单胞菌的研究进展[J].西南民族大学学报：自然科学版，2007，33(3)：507-514.

[6] 张林源，温华军，钟震宇，等.湖北石首野生麋鹿种群大量死亡原因调查[J].畜牧与兽医，2011，43(4)：89-91.

[7] 单云芳，钟震宇，程志斌，等.不同栖息地麋鹿肠道寄生虫的调查研究[J].黑龙江畜牧兽医，2017(3)：240-242.

[8] 郭定宗，邹苗，温华军，等.麋鹿肠道寄生虫感染流行病学调查[J].畜牧与兽医，2016，48(2)：112-115.

[9] 杨祎程，王雯慧，祁珊珊，等.贝氏莫尼茨绦虫感染绵羊对小肠局部黏膜淋巴组织的影响[J].畜牧兽医学报，2012，43(1)：112-118.

[10] 孙爱国，狄敏，唐德琦，等.长颈鹿血矛线虫病的诊治[J].畜牧与兽医，2014，46(4)：61-63.