甘草酸二铵对人毛囊生长作用及对Wnt/β连环蛋白信号通路的影响

韩乐 刘本 陈贤燕 蒋雨辰 邓文佳 万苗坚510630广州，中山大学附属第三医院皮肤科

已有研究表明，中药何首乌、女贞子、甘草等均对毛发生长有较明显的促进作用［1⁃2］，其中甘草酸类药物如甘草酸苷、甘草酸二铵治疗斑秃具有显著的疗效［3］。现有研究表明，甘草酸苷可通过抑制斑秃患者Th1型细胞因子的表达从而发挥治疗效果［4］，甘草酸二铵则可通过减少脱毛小鼠毛囊细胞的损伤来促进毛发生长［5］。甘草酸二铵作为中药甘草的第3代提取物，具有抗炎、保护肝细胞膜、改善肝功能等作用［6］，而对毛发生长的作用机制尚不十分明确。我们采用不同浓度甘草酸二铵培养人毛囊来探讨其对人毛囊生长的作用，为开发新药提供理论依据。同时通过免疫荧光对毛囊增殖情况以及Wnt/β连环蛋白信号通路各主要分子表达情况进行评估，为进一步阐明甘草酸二铵调控毛发生长作用的机制奠定基础。

一、材料与方法

（一）材料：

1.标本来源：人头皮标本取自中山大学附属第三医院神经外科手术及广州市粤秀整形医院植眉手术中废弃的枕部或额顶部头皮。共5例，其中男2例，女3例，年龄34±9.0（23～48）岁。供皮区头皮正常完整，毛发生长正常，无感染、脱发等其他毛发疾病。本研究通过中山大学附属第三医院医学伦理委员会批准，志愿者均签署知情同意书。

2.主要试剂与仪器：甘草酸二铵（纯度≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、配制的Williams E无血清培养基［美国Gibco公司，各成分终浓度：谷氨酰胺2 mmol/L、4⁃羟乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）2 mmol/L、氢化可的松10 μg/L、牛胰岛素10 mg/L、转铁蛋白10 mg/L、亚硒酸钠10 μg/L、青霉素1× 105μg/L、链霉素100 mg/L］。鼠抗人ki67抗体（1∶100）、兔抗人β连环蛋白（1∶500）、糖原合成激酶3β（GSK3β，1∶500）、p⁃GSK3β（1∶100）、淋巴增强子结合因子1（lef1，1∶500）抗体，山羊抗兔荧光二抗（1∶500），山羊抗鼠荧光二抗（1∶500）均为英国Abcam公司产品。4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、抗荧光淬灭封片剂（上海碧云天生物技术有限公司）。牛血清白蛋白（BSA，北京索莱宝科技有限公司）。

（二）方法：

1.毛囊分离与培养：将术中切下的废弃头皮（3cm×0.5cm）浸入生理氯化钠溶液并置于冰上保存，离体4 h内进行分离培养。首先用生理氯化钠溶液洗净头皮，然后转入含2%双抗（青/链霉素）磷酸盐缓冲液（PBS）中漂洗2 min，再转入含1%双抗的PBS溶液中漂洗两遍，各2 min。在解剖显微镜下依次将头皮分为粗胚、细胚及单株毛囊。小心切除毛囊周围脂肪组织，真皮组织，在毛囊真、表皮连接处切断毛囊。选取结构完整的生长期毛囊进行培养。全程冰上操作。

用显微镊将已分离的毛囊小心转移至每孔含有500 μl Williams E培养基的24孔板中，每孔1根。倒置显微镜下观察毛囊形态并拍照，测量初始长度并记录。置于37℃、5%CO2培养箱中悬浮培养。培养24h后选取生长长度在0.3mm左右的毛囊进行分组培养。每组15根，分别加入含有甘草酸二铵浓度为 0.1 μmol/L、0.01 μmol/L、0.001 μmol/L、0.000 1 μmol/L 的Williams E培养基中，并设置不添加甘草酸二铵的Williams E培养基组为对照组。每天观察毛囊生长形态，拍照并记录长度。

2.免疫荧光技术评估毛囊毛母质细胞增殖情况：将培养第10天的毛囊固定于4%甲醛中，沿毛囊纵轴进行石蜡包埋，切成厚度为3 μm石蜡切片数片。选取结构完整切片二甲苯脱蜡2次，梯度乙醇水化各5 min，过水后置于乙二胺四乙酸（EDTA）修复液（pH=9）中高压抗原修复，自然冷却后PBS清洗3遍，滴加30 μl 5%BSA稀释后的ki67一抗覆盖组织，4℃孵育过夜。PBS洗涤玻片3次后，滴加相对应稀释后的二抗30 μl，室温避光孵育1 h。PBS清洗3次后加入10 μl DAPI避光孵育10 min，PBS过水后滴加抗荧光淬灭封片剂封片。置于荧光显微镜下观察并采集图像。

3.免疫荧光技术检测毛囊毛母质细胞中Wnt/β连环蛋白信号通路分子表达情况：选取3例标本，每例收集3根毛囊，按照免疫荧光技术评估毛囊毛母质细胞增殖情况的方法，依次滴加相应比例稀释后的β连环蛋白、GSK3β、p⁃GSK3β、Lef1一抗及相对应的二抗，同样的方法进行观察并采集图像。用Image J软件将所获取图片转为灰度图，测量毛母质灰度值，即吸光度值，以代表荧光强度，每种分子重复检测3次，用半定量的方法比较各组吸光度值，进行统计学分析，以此来评判各组Wnt/β连环蛋白信号通路各主要分子β连环蛋白、GSK3β、p⁃GSK3β和Lef1的表达差异。

（三）统计学分析：采用SPSS22.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示。各组毛囊生长长度数据采用重复测量方差分析，Wnt/β连环蛋白信号通路各主要分子平均吸光度值的数据采用单因素方差分析，组间比较均采用LSD法进行两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1.毛囊生长速度：每天换液并测量毛囊生长长度，可以见到各组毛囊生长良好，表现为毛干明显伸出毛囊顶端，在一定时间内各组毛囊生长长度均随培养时间的延长逐渐增加。与对照组相比，各浓度甘草酸二铵培养组毛囊毛干延伸长度均有所增加，以0.01 μmol/L组最为明显，见图1。如图1所示，不同组毛囊不同时间毛干生长长度可看作一般线性模型。重复测量方差分析显示，不同浓度甘草酸二铵对毛囊生长促进作用不同，即组别因素有统计学意义（F=3.011，P＜0.05）；随培养时间的延长，毛囊生长长度也逐渐增加，即时间因素有统计学意义（F=388.978，P＜0.05）；药物浓度与培养时间不存在交互作用（F=2.09，P＞0.05），即各浓度甘草酸二铵对毛囊生长的促进作用随时间的变化趋势相同。采用LSD法进行两两多重比较，0.01 μmol/L甘草酸二铵毛囊生长长度显著长于对照组（P＜0.05），而其余各组与对照组相比差异无统计学意义（均P＞0.05）。

2.毛囊形态改变：可以观察到，对照组及0.1 μmol/L、0.001 μmol/L、0.000 1 μmol/L甘草酸二铵组毛囊在培养第6天出现毛母质变细，真皮乳头形态更加椭圆，黑素减少以及毛囊不同程度的弯曲扭折，开始进入退行期早期，而0.01μmol/L浓度组直至培养第10天仍未出现较明显的退行改变，见图2。

3.毛囊毛母质细胞增殖：免疫荧光显示，ki67主要表达于毛母质细胞核中，核内ki67阳性分子被染成红色（图3A～3E，白色箭头所指核内红色荧光）。如图3所示，与对照组相比，0.1、0.01、0.001 μmol/L浓度组毛母质细胞中ki67阳性细胞均较多，0.000 1 μmol/L浓度组无明显差异。

4.毛母质细胞中Wnt/β连环蛋白信号通路各分子表达：如图4所示，β连环蛋白、GSK3β、p⁃GSK3β主要表达于细胞质中，呈绿色荧光，而Lef1集中表达于细胞核中，也表现为绿色荧光，各分子在各组毛囊中均有不同程度表达。单因素方差分析显示，β连环蛋白、p⁃GSK3β、Lef1在各组中的表达差异有统计学意义（F=12.604、16.65、15.266，均P＜0.05），而GSK3β在各组中的表达差异无统计学意义（F=1.472，P＞ 0.05）。LSD⁃t检验显示，0.1、0.01、0.001μmol/L甘草酸二铵组毛母质细胞中β连环蛋白、p⁃GSK3β、Lef1平均吸光度值均显著高于对照组（均P＜0.05），而0.000 1 μmol/L甘草酸二铵组这3个分子与对照组相比，差异无统计学意义（均P＞0.05）。见表1。

图1 不同浓度甘草酸二铵体外培养毛囊生长长度（mm）0.01 μmol/L 甘草酸二铵组与对照组、0.1 μmol/L、0.001 μmol/L、0.000 1 μmol/L甘草酸二铵组相比，显著延长毛干生长长度

图2 各浓度甘草酸二铵体外培养毛囊10 d的形态（×40） 0.01 μmol/L甘草酸二铵组与对照组、0.1 μmol/L、0.001 μmol/L、0.000 1 μmol/L甘草酸二铵组相比，毛囊生长期显著延长

图3 各浓度甘草酸二铵体外培养毛囊中ki67表达（×200） 3A：对照组；3B：0.1 μmol/L甘草酸二铵组；3C：0.01 μmol/L甘草酸二铵组；3D：0.001 μmol/L甘草酸二铵组；3E：0.000 1 μmol/L甘草酸二铵组；与对照组相比，0.1、0.01、0.001 μmol/L甘草酸二铵组毛母质细胞中ki67阳性细胞均明显增多，0.000 1 μmol/L甘草酸二铵组无明显变化

图4免疫荧光观察不同浓度甘草酸二铵体外培养毛囊Wnt/β连环蛋白信号通路各主要分子的表达（×200） 与对照组相比，0.1、0.01、0.001 μmol/L甘草酸二铵组毛母质细胞中β连环蛋白、p⁃GSK3β、Lef1表达量增多，GSK3β在各组中的表达量均无明显差异

表1 各浓度甘草酸二铵体外培养毛囊Wnt/β连环蛋白信号通路各主要分子表达情况（平均吸光度值，±s）

表1 各浓度甘草酸二铵体外培养毛囊Wnt/β连环蛋白信号通路各主要分子表达情况（平均吸光度值，±s）

注：均n=3；0.1、0.01、0.001 μmol/L甘草酸二铵组毛母质细胞中β连环蛋白、p⁃GSK3β、Lef1表达量显著高于对照组（均P＜0.05）

甘草酸二铵浓度（μmol/L）0（对照组）0.1 0.01 0.001 0.000 1 F值P值β连环蛋白0.045 0±0.002 8 0.063 0±0.002 8 0.067 5±0.005 0 0.064 5±0.006 4 0.042 0±0.005 7 12.604 0.008 GSK3β 0.028 0±0.004 2 0.032 5±0.005 0 0.032 0±0.004 2 0.034 0±0.001 4 0.023 0±0.008 5 1.472 0.336 p⁃GSK3β 0.040 0±0.002 8 0.059 5±0.002 1 0.059 5±0.006 4 0.055 5±0.002 1 0.037 5±0.003 5 16.65 0.004 Lef1 0.021 0±0.004 2 0.036 5±0.002 1 0.042 5±0.003 5 0.041 5±0.002 1 0.024 5±0.005 0 15.266 0.005

三、讨论

毛囊具有周期性循环的自我更新系统，经历生长期、退行期、休止期的不断循环而完成毛发的生长与更新［7］。自毛囊发育成熟以来，一组含有强增殖能力的毛母质细胞群在生长期的不断增殖分化使得毛干延长［8］。因此，促进毛母质细胞的增殖，延长毛囊生长期，对毛囊生长具有重要意义。

刘维等［9］发现，甘草甜素及甘草次酸具有肾上腺皮质激素样作用，可促进毛发生长，甘草次酸还可抑制小鼠生殖腺产生睾酮，对治疗雄激素性脱发有利，甘草酸二铵作为甘草有效成分的第3代提取物，同样具备这些作用。我们研究发现，在体外培养的毛囊中，0.01 μmol/L甘草酸二铵具有较明显促进毛囊生长作用，且从培养第4天开始表现出此作用，说明甘草酸二铵发挥促毛囊生长作用不仅与药物浓度有关，也与药物作用时间相关。毛囊进入退行期的典型形态改变包括毛母质变细，真皮乳头形态更加椭圆以及黑素减少，毛干呈杵状，毛囊出现弯曲扭折［10］，我们发现，0.01 μmol/L甘草酸二铵能明显推迟毛囊进入退行期。

毛母质细胞中ki67分子的表达是评估毛囊增殖活性的重要指标，生长期表达增多而退行期表达减少。免疫荧光结果显示，0.01 μmol/L甘草酸二铵体外培养的毛囊毛母质细胞增殖活性明显增强，更加验证了0.01μmol/L甘草酸二铵有促毛囊生长及延长生长期的作用，而较高0.1 μmol/L浓度及较低0.001μmol/L、0.0001μmol/L浓度的甘草酸二铵没有表现出这两种作用。虽然0.1 μmol/L浓度及0.001 μmol/L浓度组毛囊毛母质细胞与对照组相比仍表现出较强的增殖活性，这仅说明甘草酸二铵可促进毛母质细胞增殖，而只有适宜浓度的甘草酸二铵才能发挥最明显的促进毛囊生长及延长毛囊生长期的作用。浓度过高可能会产生细胞毒作用［11］，而过低则未达到起效浓度。章建华等［5］发现，高剂量甘草酸二铵可促进脱毛小鼠毛发生长，而低剂量组未见明显作用，证实其发挥作用确实是与药物浓度相关。

毛囊能够实现生长与周期调控的重要先决条件是表皮与其下间质之间分子学信号的交流［12］，其中最主要的是Wnt/β连环蛋白经典信号途径及骨形态发生蛋白/转化生长因子β（BMP/TGF⁃β）信号通路。Wnt/β连环蛋白信号通路激活时，诱导毛发进入生长期，促进毛发生长，而BMP信号通路激活则加速毛囊退行，抑制其生长，两者相互拮抗来调控毛囊生长周期［13⁃14］。当Wnt/β连环蛋白信号通路被激活时，胞质内GSK3β被磷酸化失活，胞质β连环蛋白水平升高，此后被转运至胞核内，促进核内Lef分子的表达并与DNA结合蛋白Lef/Tcf家族成员结合，形成一个活化的转录因子复合体，从而激活下游靶基因的转录，最终实现毛发的生长［15］。本研究结果显示，0.1、0.01、0.001 μmol/L甘草酸二铵体外培养毛母质细胞中β连环蛋白、p⁃GSK3β、Lef1表达量均明显高于对照组，提示一定浓度甘草酸二铵可能通过激动Wnt/β连环蛋白信号通路，使胞质β连环蛋白表达增多，GSK3β磷酸化，使得p⁃GSK3β增多，进一步促进核内Lef1表达，激活下游靶基因转录，最终实现毛囊生长期的延长及毛发生长。此外，虽然0.1及0.001 μmol/L浓度组毛囊中Wnt/β连环蛋白信号通路各分子表达量增加，但最终并未表现出促进毛发生长及延长生长期的作用，不排除有其他信号通路参与此作用，如对毛囊生长有负性调节作用的BMP信号通路。综上所述，0.01 μmol/L甘草酸二铵可促进人体外毛囊生长，延长生长期，且有可能通过激活Wnt/β连环蛋白信号通路而发挥此作用。

［1］李云飞,林佩,贺嫣然,等.天然药物对毛发生长影响因素调节作用的研究进展［J］.中草药,2014,45（11）:1655⁃1662.doi:10.7501/j.issn.0253⁃2670.2014.11.029.

［2］张兴洪,范卫新.何首乌、女贞子等中药煎剂对体外培养的猪毛囊毛发生长的影响［J］.中华皮肤科杂志,2005,38（2）:102⁃104.doi:10.3760/j.issn:0412⁃4030.2005.02.012.

［3］白永敏.复方甘草酸苷对斑秃的临床疗效［J］.中国药房,2006,17（6）:470⁃471.doi:10.3969/j.issn.1001⁃0408.2006.06.032.

［4］秦小卫,陈丽芳.复方甘草酸苷对斑秃患者外周血单一核细胞中y干扰素、肿瘤坏死因子β表达的调节作用［J］.中华皮肤科杂 志,2011,44（12）:877⁃879.doi:10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2011.12.018.

［5］章建华,吕鹏,杨春琳,等.甘草酸二铵促进脱毛小鼠毛发生长的作用［J］.中国临床药理学杂志,2016,32（1）:55⁃58.doi:10.13699/j.cnki.1001⁃6821.2016.01.018.

［6］Zhang R,Cheng K,Xu S,et al.Metformin and diammonium glycyrrhizinate enteric⁃coated capsule versus metformin alone versus diammonium glycyrrhizinate enteric⁃coated capsule alone in patients with nonalcoholic fatty liver disease and type 2 diabetesmellitus［J］.GastroenterolResPract,2017,2017:8491742.doi:10.1155/2017/8491742.

［7］Stenn KS,Paus R.Controls of hair follicle cycling［J］.Physiol Rev,2001,81（1）:449⁃494.

［8］Murphy GF.Mechanism of apoptotic regulation of follicular regression:toward understanding the molecular basis for tissue remodeling and regeneration［J］.Am J Pathol,2001,158（6）:1899⁃1901.doi:10.1016/S0002⁃9440（10）64657⁃3.

［9］刘维,陈达灿.中草药治疗雄激素性脱发的药理与实验研究概况［J］.中国中西医结合皮肤性病学杂志,2003,2（3）:191⁃193.doi:10.3969/j.issn.1672⁃0709.2003.03.036.

［10］Kloepper JE,Sugawara K,Al⁃Nuaimi Y,et al.Methods in hair research:how to objectively distinguish between anagen and catagen in human hair follicle organ culture［J］.Exp Dermatol,2010,19（3）:305⁃312.doi:10.1111/j.1600⁃0625.2009.00939.x.

［11］孙宇,杨淑霞,涂平,等.女贞子等对人头皮毛囊体外培养影响的研究［J］.中华皮肤科杂志,2005,38（5）:303⁃305.doi:10.3760/j.issn:0412⁃4030.2005.05.016.

［12］Schneider MR,Schmidt⁃Ullrich R,Paus R.The hair follicle as a dynamic miniorgan［J］.Curr Biol,2009,19（3）:R132 ⁃142.doi:10.1016/j.cub.2008.12.005.

［13］Zhang Y,Tomann P,Andl T,et al.Reciprocal requirements for EDA/EDAR/NF⁃kappaB andWnt/beta⁃cateninsignaling pathways in hair follicle induction［J］.Dev Cell,2009,17（1）:49⁃61.doi:10.1016/j.devcel.2009.05.011.

［14］Plikus MV,Mayer JA,de la Cruz D,et al.Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration［J］.Nature,2008,451 （7176）:340 ⁃344.doi:10.1038/nature06457.

［15］Nguyen H,Merrill BJ,Polak L,et al.Tcf3 and Tcf4 are essential for long⁃term homeostasis of skin epithelia［J］.Nat Genet,2009,41（10）:1068⁃1075.doi:10.1038/ng.431.