硒锗组合对蛹虫草主要活性成分的协同效应

王菊凤，李鹄鸣，杨道德

(1.吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南吉首416000;2.中南林业科技大学野生动植物保护研究所，湖南长沙410004)

蛹虫草(Cordyceps militaris)是我国传统的名贵药用真菌，为子囊菌亚门麦角菌目麦角菌科虫草属的模式种。蛹虫草中含有大量的虫草素、腺苷和虫草多糖，其特殊的医疗保健功能已经引起国内外专家的高度重视。虫草素和虫草多糖是目前衡量蛹虫草品质的重要指标［1］，同时也是临床应用的主要功能因子［2］，近年来已成为虫草领域的研究热点之一。

微量元素在药用真菌栽培中具有重要作用，主要是通过真菌菌丝体的富集能力，对药用真菌本身活性物质的含量产生影响，或者与之结合，从而增加药用真菌的营养保健功能。硒是目前已知的14种人体必需的微量元素之一，被誉为“抗癌之王”，国内外学者对利用生物转化法富集硒进行了大量研究［3］。微量元素锗的有机化合物，在人类的生命过程中起着重要的作用，并与人体健康有着密切的关系。天然有机锗是许多药用植物的有效成分之一。众所周知的人参和其他药用植物，如枸杞、灵芝、当归、黄芪等之所以具有独特的强身滋补等保健功能，除了与它们的主要活性成分有关以外，还与它们都富含的有机锗有关。除此以外，有机锗还具有很强的抗肿瘤作用。因此，含锗生物的转化研究逐渐成为微量元素研究范围内较为活跃的领域［4-5］。

目前，关于微量元素硒、锗对蛹虫草活性物质影响的研究较少。特别是硒、锗对蛹虫草的协同效应还未见报道。为此，以固体培养蛹虫草子实体作为富硒、锗的载体，研究不同质量浓度的硒锗组合对蛹虫草子实体生长发育的影响，在此基础上进一步研究不同质量浓度的硒锗组合对子实体内虫草素、腺苷和虫草多糖含量的影响，为获得虫草素和虫草多糖高含量的菌株提供候选资源，为富硒锗蛹虫草的产业化开发提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 供试蛹虫草菌株CM－C由中南林业科技大学生命科学与技术学院提供。

1.1.2 斜面培养基 PDA培养基，即马铃薯葡萄糖琼脂培养基:去皮马铃薯200 g(煮汁)、葡萄糖20 g、磷酸二氢钾1 g、琼脂20 g、水1 000 mL，自然pH值。

1.1.3 固体基本培养基 含大米 83%、玉米粉10%、白砂糖2%、蛋白胨2%、蚕蛹粉2.5%、硫酸镁0.2%、柠檬酸铵 0.2%、磷酸二氢钾 0.1%、维生素 B1微量(1 L水加5～6片)、水，pH 值5～7。

1.2 方法

1.2.1 样品培养 首先选择Na2SeO3质量浓度依次为 5、10、15 mg/L，GeO2质量浓度依次为 100、200、300、400 mg/L，按照表1正交设计配制成12个硒锗组合质量浓度组，然后分别添加在基本培养基中。常规灭菌，常规接种，对照组使用基本培养基，每个质量浓度组重复处理50瓶，按常规瓶栽法培养及管理，置于18～23℃、空气相对湿度85%～95%、光照强度300～400 lx、通风良好的环境条件下培养。1个生长周期即将结束时，分别采收子实体，每个质量浓度选取10瓶生长典型的虫草，首先记录虫草的根数，再用游标卡尺测量每根虫草的长度，最后综合10瓶虫草的平均值，得到子实体的平均长度。同样每个质量浓度选取10瓶生长典型的虫草，分别称鲜质量，再称干质量。

表1 硒锗正交设计质量浓度设置 mg/L

1.2.2 虫草素和腺苷的提取分离和纯化 取蛹虫草子实体于65℃下干燥，粉碎，过筛［孔径(180±7.6)μm］。精确称取虫草粉1 g，加蒸馏水25 mL，于95℃下水浴保温1 h，过滤;滤渣再加入蒸馏水25 mL，于95℃下水浴保温1 h，过滤，合并2次滤液，冷却，50 mL容量瓶定容，用于测定虫草素和腺苷含量。

1.2.3 虫草素和腺苷含量的测定 测定条件完全按农业行业标准进行。用LC－2010CHT高效液相色谱仪(德国制造)测定，以乙腈－水(7∶93)为流动相，流速1 mL/min，检测波长260 nm，虫草素和腺苷标样均购自美国Sigma公司。上述1.2.2中样品溶液经微孔滤膜(0.50 μm)过滤作样品溶液。用外标法计算样品中虫草素和腺苷的含量。

1.2.4 虫草多糖含量的测定 样品制备:蛹虫草子实体在65 ℃下干燥，粉碎，过筛［孔径(180±7.6)μm］。准确称取虫草粉1 g，加30 mL蒸馏水在95℃下保温1 h提取多糖，冷却过滤，保存滤液，滤渣再加水30 mL重复上述过程2次。合并3次提取的滤液，定容至100 mL。

采用苯酚－硫酸法［6］测定多糖的含量。精确吸取样品处理液1.0 mL，置于10 mL比色管中，加蒸馏水补充至2.0 mL。空白对照管则用蒸馏水。样品管和空白管中加入6%的苯酚溶液1.0 mL，摇

匀，然后迅速加入浓硫酸5.0 mL，摇匀，在室温下放置5 min，置沸水浴中加热15 min，取出后迅速冷却至室温，于490 nm处，以空白校正零点，用1 mL比色皿测吸光度。

1.2.5 数据分析 所得数据采用SPSS 19.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度硒锗组合对蛹虫草子实体生长情况的影响

表2显示不同质量浓度硒锗组合处理对蛹虫草子实体颜色与长势、子实体形态、平均长度、鲜质量、干质量等生长情况的影响。图1为不同质量浓度硒锗组合处理后蛹虫草子实体生长形态比较。其中子实体均为生长20 d的长势。不论是哪个质量浓度的硒锗组合，其子实体的生长发育都很健壮旺盛，绝大部分都呈金黄色，而且要比对照组粗壮、色深。从表2可知，如果只考虑硒的浓度，从子实体形态来看，低硒浓度组子实体生长较粗壮，与对照组相比较其平均长度或短或长，而高硒浓度组子实体形态不是很有规则;但是，在生物量方面，相同条件下与对照组相比较，鲜质量与干质量都明显增大，干质量增长率最高可达14.50%。说明硒锗组合产生了明显的协同效应，硒锗能促进蛹虫草子实体生物量的增加。

表2 不同质量浓度硒锗组合对蛹虫草子实体生长情况的影响

2.2 不同质量浓度硒锗组合对蛹虫草子实体中虫草素含量的影响

由图2可见，在不同质量浓度硒锗组合处理条件下，蛹虫草子实体中虫草素含量发生了明显的变化，而且所有样品处理组的虫草素含量全部比对照组的虫草素含量高。当硒锗组合质量浓度为10 mg/L×300 mg/L时，子实体中虫草素含量达到最高，为1.12%，是对照组的2.89倍;当硒锗组合质量浓度为10 mg/L×400 mg/L与15 mg/L×100 mg/L 时，子实体中虫草素含量次之，分别为1.02%和0.96%，此时也明显高于对照组的0.387%，分别是对照组的2.64倍和2.48倍。从图2还可以看出，随着培养基中硒锗质量浓度的增加，虫草素含量首先上升，达到最高值以后开始下降。由此可见，硒锗有利于蛹虫草子实体中虫草素的合成，而且硒锗的最适组合质量浓度为10 mg/L×300 mg/L。方差分析得知，各试验组间差异显著(P＜0.05)。

图1 不同质量浓度硒锗组合处理蛹虫草子实体形态比较

图2 不同质量浓度硒锗组合对蛹虫草子实体中虫草素含量的影响

2.3 不同质量浓度硒锗组合对蛹虫草子实体中腺苷含量的影响

不同质量浓度硒锗组合对蛹虫草子实体内腺苷的合成影响较大(图3)。总的来说，所有样品处理组的腺苷含量比对照组的腺苷含量高，说明硒锗组合有利于蛹虫草子实体中腺苷的合成，由于腺苷是虫草素合成的直接前体物质，因此，如以上分析，同样有利于蛹虫草子实体中虫草素的合成。当锗质量浓度在100～400 mg/L，子实体内腺苷含量变化不大。当硒质量浓度较高为15 mg/L、锗质量浓度较低为100 mg/L时，子实体中腺苷含量相对最高为0.116%，是对照组的2.7倍。可知不同质量浓度硒锗组合的协同效应以高硒低锗为宜。由方差分析得知，各试验组间差异显著(P＜0.05)。

图3 不同质量浓度硒锗组合对蛹虫草子实体中腺苷含量的影响

2.4 不同质量浓度硒锗组合对蛹虫草子实体中虫草多糖含量的影响

图4显示了不同质量浓度硒锗组合处理对蛹虫草子实体中虫草多糖含量影响的动态变化趋势。由于硒锗组合的协同效应影响，样品处理组的虫草多糖含量全部比对照组的虫草多糖含量高，方差分析得知，各试验组间差异显著(P＜0.05)。说明硒锗有利于蛹虫草子实体中多糖的生物合成积累。当硒锗组合质量浓度为10 mg/L×200 mg/L时，多糖的合成量达到最高(5.72%)，为对照组(2.96%) 的1.93倍。从图4还可以看出，当锗质量浓度在100～400 mg/L，随着培养基中锗质量浓度的增加，虫草多糖含量开始时明显增加，但与硒产生协同效应时，虫草多糖含量又出现下降趋势，推测这种现象可能是由于硒浓度的增加致使虫草多糖的合成受到制约的缘故。

图4 不同质量浓度硒锗组合对蛹虫草子实体中虫草多糖含量的影响

3 结论与讨论

虫草素和虫草多糖是虫草属真菌特异性合成的2种次生代谢产物，具有免疫调节、抗肿瘤、抗疲劳、抗菌、抗病毒、调节心肺等功能［7-8］。蛹虫草中虫草素和虫草多糖的含量及其开发利用是目前人们关注的热点研究内容［9-10］，腺苷是初生代谢产物，是虫草素合成的直接前体物质，其本身也具有很好的生理活性［11］。

从本试验结果来看，不同质量浓度硒锗组合处理组蛹虫草子实体生长发育健壮旺盛，色深、粗壮，生物量明显大于对照组;而且虫草素、腺苷和虫草多糖的含量都显著增高。说明不同质量浓度硒锗组合对蛹虫草子实体中虫草素、腺苷和虫草多糖的产生都有不同程度的促进作用，特别是对虫草素的影响最大，最高达到了对照组的2.89倍。相关的研究显示，单因素硒(质量浓度为5.5 mg/L)处理蛹虫草中虫草素的含量是空白组的1.21倍［12］;单因素锗(质量浓度为300 mg/L)处理蛹虫草中虫草素的含量是空白组的 1.09 倍［5］，而本试验结果显示的 2.89 倍已经明显超过了以上硒、锗单独试验之和(1.21+1.09=2.30)。由此说明，硒锗组合对虫草素的影响表现出显著的协同正效应。本试验结果还表明，硒锗组合使多糖的合成量达到对照组的1.93倍，显著高于硒、锗对虫草多糖的单独影响结果，硒锗组合同样表现出明显的协同正效应。因而硒锗有利于蛹虫草子实体中主要生理活性物质的合成与积累。因此，完全可以在培养基中同时加入硒锗来生产合成这些主要的生理活性物质，而且还可以通过生物量的指标快速筛选出子实体阶段高虫草素和高虫草多糖含量的菌株，因而拓展了虫草素和虫草多糖的开发利用途径。

关于硒锗是如何影响蛹虫草子实体生长发育以及促进主要生理活性物质的生物合成，笔者推测，硒锗作为真菌生长不可缺少的微量元素能够刺激菌丝的生长，促使子实体形态的构成以及影响细胞内的物质代谢和能量代谢，例如，直接增加腺苷的含量，从而促进虫草素产量的增加;并通过类似的机制促进了虫草多糖的合成［13］。还有一种可能是，硒锗离子的加入使得某些被刺激的酶和基因通过转录因子影响了虫草素的合成，对此现象的机制还需深入研究［9，14］。

从试验结果还可看到，高质量浓度的硒锗组合对虫草素和虫草多糖含量所表现出来的协同效应没有低质量浓度的明显，可能是高质量浓度的硒锗组合对蛹虫草子实体的生长发育产生一定的抑制作用，从而对生理活性物质的形成产生一定的影响。因此，在硒、锗作为微量元素添加时均以低质量浓度为宜。另外，本试验中所测得的腺苷最高含量是在硒质量浓度为15 mg/L、锗质量浓度为100 mg/L时，因此对腺苷而言，高硒低锗条件下两者的协同效应发挥得最好。这一条件也有可能成为获得高产量虫草素的另一途径。

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