响应面优化米曲霉固态发酵豆粕制备A C E抑制肽条件

李景，陈定刚

（1.天津天狮学院生物与食品工程学院，天津301700；2.金天源食品科技（天津）有限公司，天津300452）

高血压是我国人群脑卒中及冠心病发病的首位危险因素，严重危害人群健康，我国高血压患者已超过2.7亿，并以每年1 000万人的速度递增，高血压的预防和治疗已成为迫切需要解决的重大医学和社会问题[1]，临床上使用的抗高血压药物存在一定的副作用[2]，而食源性ACE抑制肽具有较强的降压活性和良好的安全性[3-5]。我国大豆资源丰富，豆粕作为大豆油加工副产品，其蛋白较高约为48%左右，营养价值较高[6]，但却一直作为饲料应用，附加值较低，若豆粕可作为制备ACE抑制肽的原料，其利用价值可大大提高。

目前研究食源性ACE抑制肽的制备方法主要集中在酶法和微生物发酵法，发酵法可利用微生物在食品发酵过程中产生的蛋白酶水解原料蛋白得到ACE抑制肽，成本低廉、工艺过程简便、条件温和[7]，固态发酵更有培养基简单、产率高、耗能低、环境污染少、适合规模制备等优点[8]，而以豆粕为原料制备ACE抑制肽主要集中在酶法[9-11]，微生物发酵法则较少报道。米曲霉作为美国食品药品监督管理局公布的安全菌株广泛应用于食品行业[12]，且米曲霉在生长过程中所产蛋白酶较多[13-14]，因而可利用米曲霉固态发酵豆粕制备ACE抑制肽。

本文以豆粕为原料，米曲霉为发酵菌种，应用响应面分析法优化米曲霉固态发酵豆粕制备ACE抑制肽的条件，以期为豆粕的深加工及微生物发酵豆粕制备ACE抑制肽提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

米曲霉（Aspergillus oryzae 3.4437）：中国微生物普通微生物保藏管理中心；豆粕（蛋白质含量为48.74%）：金天源食品科技（天津）有限公司；马尿酰-组胺酰-亮氨酸（Hip-His-Leu，HHL）、血管紧张素转化酶（ACE）、Gly-Gly-Tyr-Arg四肽：美国 Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

TG16KR离心机：长沙东旺试验仪器有限公司；SB-300DTDN万能粉碎机：上海永久中药机械制造有限公司；XMTD-204电热恒温水浴锅：天津欧诺仪器仪表有限公司；YP1201N电子天平：赛多利斯科学仪器公司；SW-CJ-2G净化工作台：苏州净化设备有限公司；MJ-78A高压蒸汽灭菌锅：施都凯仪器设备（上海）有限公司；BPX-52电热恒温培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；UV1000紫外可见分光光度计：上海天美科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化

斜面培养基：硝酸钠3.0 g，蔗糖30.0 g，硫酸镁0.5 g，氯化钾0.5 g，硫酸铁0.01 g，磷酸氢二钾1.0 g，琼脂 15 g，蒸馏水 1.0 L，pH 6.0，115 ℃灭菌 20 min。无菌操作条件下转接保藏菌种至斜面，于30℃恒温培养96 h，转接2次～3次，至其充分活化。

1.3.2 孢子菌悬液的制备

无菌操作条件下，以10 mL无菌生理盐水冲洗已活化的米曲霉培养斜面，制成孢子悬液，混匀后用血球计数板测定孢子数，并稀释调整悬液的孢子数为107个/mL。

1.3.3 发酵培养

在前期研究的基础上，确定米曲霉发酵培养基组成成分为：豆粕（粉碎过60目筛）10 g，麸皮5 g。调整培养基水分含量为50%，121℃灭菌20 min。取制备好的菌悬液，按一定的接种量（g/100 g，以干基计）接入已灭菌的发酵培养基，30℃条件下进行发酵培养。取发酵培养物5 g，加入200 mL蒸馏水，在25℃、200 r/min条件下水浴振荡2 h，5 000 r/min条件下离心20min，经0.45 μm滤膜过滤作为ACE抑制肽样品溶液[15]。

1.3.4 发酵培养物多肽得率的测定

取ACE抑制肽样品溶液2.5 mL，加入2.5 mL的10%三氯乙酸水溶液，混匀后静置10 min，在4 000 r/min条件下离心20 min后，将上清液全部转移到50 mL容量瓶中并用5%的三氯乙酸液定容。吸取6.0 mL溶液至试管，加入双缩脲试剂4.0 mL，混合均匀后静置10 min，在2 000 r/min条件下离心10 min后，取上清液于540 nm处测定吸光度值，对照Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准曲线（图1），求出样品溶液中的多肽质量浓度（mg/mL），进而求出样品中的多肽得率[16]（见公式）。由Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准曲线，得到回归方程y=0.153 3x+0.003 2，R2=0.997 6，呈现良好线性。

图1 Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准曲线Fig.1 The standard curve of Gly-Gly-Tyr-Arg

1.3.5 ACE抑制率测定

采用紫外分光光度法，参照文献[17]进行测定。

1.3.6 单因素试验

1）含水量的影响：分别调整发酵培养基水分含量 45%、50%、55%、60%、65%，接种量为 6%，30℃发酵培养60 h后，测定其发酵培养物的多肽得率和ACE抑制率，确定培养基最佳含水量。

2）接种量的影响：调整发酵培养基水分含量为55%，接种量分别为2%、4%、6%、8%、10%，30℃发酵培养60 h后，测定其发酵培养物的多肽得率和ACE抑制率，确定培养基最佳接种量。

3）发酵温度的影响：发酵培养基水分含量调整为55%，接种量为6%，发酵温度分别为26、28、30、32、34℃，发酵培养60 h后，测定其发酵培养物的多肽得率和ACE抑制率，确定培养基最佳发酵温度。

4）发酵时间的影响：发酵培养基水分含量调整为55%，接种量为6%，发酵温度30℃，分别发酵培养 36、48、60、72、84 h 后，测定其发酵培养物的多肽得率和ACE抑制率，确定最佳发酵培养时间。

1.3.7 响应面法优化试验

在单因素试验基础上，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，确定中心组合试验因素与水平，并以ACE抑制率为响应值进行响应面分析试验，优化米曲霉发酵豆粕制备ACE抑制肽的发酵条件。因素水平及编码表见表1。

表1 因素水平及编码表Table 1 The table of factors and levels

1.3.8 数据处理

采用Desigh-Expert 8.0.6和Origin进行数据处理与分析及绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 含水量的影响

米曲霉属于好气性真菌，氧气对于米曲霉的生长和代谢起到重要作用，在培养基质量一致的前提下，培养基含水量直接影响氧气的供应，同时水分也是微生物生长代谢的重要物质，因此将发酵培养基含水量作为考查因素之一。含水量对多肽得率和ACE抑制率的影响见图2。

图2 含水量对多肽得率和ACE抑制率的影响Fig.2 The effect of water content on peptide yield and ACE inhibition ratio

图2可知，当发酵培养基含水量为55%时，多肽得率和ACE抑制率最高，在此条件下最适宜进行发酵培养制备ACE抑制肽。发酵培养基含水量为45%和50%时，多肽得率和ACE抑制率最低，可能由于含水量较低，可溶性营养物质的溶解不充分，影响米曲霉的正常生长。发酵培养基含水量为60%和65%时多肽得率和ACE抑制率略低，可能是由于含水量过高，影响发酵培养基通气量[18]，米曲霉的生长和产酶能力受限，进而影响多肽得率及ACE抑制率。

2.1.2 接种量的影响

接种量决定了微生物在培养基中生长繁殖的速度，较大的接种量可使米曲霉菌丝繁殖很快到达高峰，减少杂菌生长，但接种量过大或过小，均对发酵不利。接种量过大，培养基营养消耗过大，代谢废物过多，影响多肽得率和ACE抑制率；接种量过小在一定的培养时间条件下，菌体的生产效率较低，多肽得率和ACE抑制率也较低。接种量对多肽得率和ACE抑制率的影响见图3。由图3可知，接种量选取6%为宜。

2.1.3 发酵温度的影响

温度是影响微生物生长代谢的重要因素，每种微生物都有其特定的最适宜生长的温度范围，温度过高或过低都会影响米曲霉的生长。发酵温度对多肽得率和ACE抑制率的影响见图4。

由图4可知，多肽得率和ACE抑制率在发酵温度为30℃时最高，分别为19.5%和50.98%。温度过低，米曲霉生长缓慢，蛋白酶活力降低；温度过高，米曲霉菌丝体老化过快，加速死亡，生长代谢受干扰，产蛋白酶活力降低。

图3 接种量对多肽得率和ACE抑制率的影响Fig.3 The effect of inoculation quantity on peptide yield and ACE inhibition ratio

图4 发酵温度对多肽得率和ACE抑制率的影响Fig.4 The effect of fermentation temperature on peptide yield and ACE inhibition ratio

2.1.4 发酵时间的影响

发酵时间对发酵过程影响显著，发酵时间过短，菌种生长有限，产酶不多，发酵不完全；发酵时间过长，发酵过度，菌体可利用营养成分较少，代谢废物过多，菌体老化，产酶减少，影响多肽得率和ACE抑制率。发酵时间对多肽得率和ACE抑制率的影响见图5。

由图5可知，随着培养时间的延长，多肽得率和ACE抑制率随之升高，超过60 h后，多肽得率和ACE抑制率升高不明显，发酵时间到达84 h时，多肽得率和ACE抑制率略有降低，为节省能耗，综合考量发酵时间选取60 h。

2.2 响应面法优化试验结果

2.2.1 响应面试验设计及回归模型的建立

图5 发酵时间对多肽得率和ACE抑制率的影响Fig.5 The effect of fermentation time on peptide yield and ACE inhibition ratio

以单因素试验结果为基础，确定发酵时间为60h，选取较优发酵培养基含水量、接种量、发酵温度3个因素为响应变量，以ACE抑制率为响应值。依据Box-Behnken中心组合试验设计原理，选取3个中心点，设计三因素三水平试验15组，试验结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table2 Thedesignandresultsoftheresponse surfaceexperimental

对表2进行回归分析，以ACE抑制率为响应值建立的二次响应面回归方程如下：

对该回归方程进行方差分析，结果见表3。

由表3方差分析可知，回归模型P<0.01，说明该模型极显著，一次项中A、C极显著（P<0.01），说明单因素中发酵温度和发酵培养基含水量对ACE抑制率有极显著的影响。二次项A2、C2及交互作用项中AC影响极显著（P<0.01），表明发酵温度和含水量对ACE抑制率有交互影响的作用。失拟项（P=0.242 5）不显著，残差由随机误差引起。模型校正决定系数Radj2=0.977 6，说明模型能解释97.76%响应值变化；模型相关系数R2=0.977 6，说明回归方程拟合度好，可用于本试验发酵条件预测。

表3 回归模型及方差分析Table 3 Regression model and analysis of variance

2.2.2 各因素之间交互作用对ACE抑制率的影响

各因素间的交互作用对响应值的影响见图6～图8。

图6 发酵温度和接种量对ACE抑制率的影响Fig.6 Response surface for the effect of fermentation temperature and inoculation quantity on ACE inhibition ratio

图8更清晰的反映出发酵温度和含水量对ACE抑制率影响较大，表现为曲线较陡峭，发酵温度和含水量之间有明显的交互作用，这与表3的方差分析中回归模型系数显著性检验结果一致。

2.2.3 验证试验

图7 接种量和含水量对ACE抑制率的影响Fig.7 Response surface for the effect of inoculation quantity and water content on ACE inhibition ratio

图8 发酵温度和含水量对ACE抑制率的影响Fig.8 Response surface for the effect of fermentation temperature and water content on ACE inhibition ratio

依据回归方程获得了米曲霉固态发酵豆粕制备ACE抑制肽的最优发酵条件，为发酵温度29.55℃，接种量6.62%，含水量55.77%，在此条件下ACE抑制率的理论值为56.16%。为验证模型的预测准确性，考虑到实际操作的方便性，选取发酵温度30℃，接种量7%，含水量56%，在此条件进行3次平行试验，测得ACE抑制率为56.03%，与理论预测值基本吻合，说明响应面分析方法对米曲霉固态发酵豆粕制备ACE抑制肽的条件优化是可行的。

3 结论

微生物发酵法为制备食源性ACE抑制肽常用方法，主要是利用微生物生长代谢所产生的蛋白酶分解原料蛋白而获得，该法条件温和、操作方便等优点，采用固态发酵更有成本较低，能耗低，不需要废水处理，对环境污染小[19]的优点。

以多肽得率和ACE抑制率为指标，通过单因素试验考查发酵时间、发酵温度、接种量和含水量单因素对米曲霉固态发酵豆粕制备ACE抑制肽的影响，确定发酵时间为60 h。利用响应面分析方法Box-Behnken中心组合试验，以ACE抑制率为指标优化米曲霉固态发酵豆粕制备ACE抑制肽条件，拟合了发酵温度、接种量和含水量对ACE抑制率影响的回归模型，结果表明模型拟合度好，发酵温度和发酵培养基的含水量对ACE抑制率影响极显著，最佳发酵条件为：发酵温度30℃，接种量7%，含水量56%，发酵时间60 h，在此条件下ACE抑制率达到56.03%，与理论预测值基本吻合，说明响应面分析方法对米曲霉固态发酵豆粕制备ACE抑制肽条件的优化是可行的。

本研究以产蛋白酶能力较强的米曲霉固态发酵豆粕制备ACE抑制肽，优化后其ACE抑制率比酶法水解豆粕所得ACE抑制率略低[9]，但差距不大，说明此方法具有一定的可行性和利用价值，存在差距原因与进一步的优化均有待研究。

[1]康玉明,李宏宝,齐杰,等.高血压中枢发病机制的研究进展[J].西安交通大学学报(医学版),2017,38(1):1-6

[2]阳远舟,黄维义.抗高血压药物的评价与研究进展[J].中外医学研究,2016,14(7):161-162

[3]Elliott P,Stamler J,Dyer AR,et al.Association between protein intake and blood pressure[J].Arch Intern Med,2006,166(1):79-87

[4]Iwaniak A,Minkiewicz P,Darewicz M.Food-Originating ACE Inhibitors,Including Antihypertensive Peptides,as Preventive Food Components in Blood Pressure Reduction[J].Compr.Rev.Food Science and Food Safety,2014,13(2):114-134

[5]Rho SJ,Lee JS,Chung YI,et al.Purificationand identification of an angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide from fermented soybean extract[J].Process Biochemistry,2009,44(4):490-493

[6]卢亚萍,冯杰.大豆多肽的性质及其研究进展[J].饲料研究,2005(11):26-29

[7]蔡高峰,黄纪念,孙强,等.大豆降压肽的制备、纯化及活性分析方法研究进展[J].中国食物与营养,2009(10):25-27

[8]黄达明,吴其飞,陆建明,等.固态发酵技术及其设备的研究进展[J].食品与发酵工业,2003,29(6):87-91

[9]温雪琴,刘屾,黄弢,等.大豆粕碱性蛋白酶水解肽及ACE抑制活性的研究[J].食品研究与开发,2014(9):9-12

[10]吴非,于胜男,李良,等.大豆降血压活性肽和抗癌活性肽的制备研究[J].中国油脂,2011,36(7):58-61

[11]于胜男,吴非.制备大豆降血压肽最佳用酶的筛选[J].食品工业科技,2010(5):199-201

[12]刘丽萍,刘丽华.米曲霉研究进展与应用[J].中国调味品,2008,33(4):28-32

[13]李诗雯.米曲霉蛋白酶系协同水解大豆蛋白的研究[D].武汉:湖北工业大学,2015

[14]李秀婷,赵进,鲁绯,等.米曲霉固态发酵产酶条件及酶活力研究[J].中国酿造,2009(2):26-28

[15]刘晓艳,于纯淼,国立东,等.固态发酵高温豆粕制备多肽饲料的最优发酵工艺条件研究[J].大豆科学,2011,30(2):285-289

[16]鲁伟,任国谱,宋俊梅.蛋白水解液中多肽含量的测定方法[J].食品科学,2005,26(7):169-171

[17]Zhejie Bao,Yujie Chi.In Vitro and In Vivo Assessment of Angiotensin-Converting Enzyme(ACE)Inhibitory Activity of Fermented Soybean Milk by Lactobacillus casei Strains[J].Current Microbiology,2016,73(2):214-219

[18]冯颖杰.米曲霉蛋白酶的酶学性质及其应用研究[D].无锡:江南大学,2015

[19]李浪,杨旭,薛永亮.现代固态发酵技术工艺、设备及应用研究进展[J].河南工业大学学报(自然科学版),2011,32(1):89-94