西青果多酚的提取纯化及其抗氧化活性分析

林款，茹琴，梁征，徐丛玥，周梅，李超英

（江汉大学武汉生物医学研究院，湖北武汉430056）

西青果为君子科植物诃子的干燥幼果，该植物主要分布于巴基斯坦和印度。在中国，西青果又名藏青果，是传统中药药材，分布于我国广东、广西、云南等地区。中医里西青果具有清热生津、解毒的作用，近年来其降血糖、抗炎、抗氧化、抗菌和神经保护等生物活性也有报道[1-4]。有研究表明，西青果提取物中主要含有诃子宁、诃子鞣酸、柯黎勒酸等化合物[5]，具有抑制大鼠肠道麦芽糖酶活性[6]和降血糖作用[7]。也有研究发现西青果的有效成分诃子宁具有具有抗炎活性，可显著降低胶原蛋白诱导的关节炎模型小鼠体内炎症因子的表达[8]。西青果中含有酚类、类黄酮和萜类化合物，也使其具有很好的抗菌活性[9]。

西青果黄酮类物质的提取已有部分研究[10]，对于西青果水提物的抗氧化活性也有所报道[11-12]，而西青果多酚的不同提取纯化方法鲜有研究报道，其多酚类物质含量和抗氧化效果也尚不清楚。本研究以西青果为研究对象，用甲醇作为提取溶剂，再用乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，过大孔树脂柱进行纯化，并采用4种体外抗氧化方法综合评价两种提取物的体外抗氧化活性，以期为从西青果中提取天然的抗氧化活性物质提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 原材料

西青果：产自广西壮族自治区玉林市兴业县，经鉴定为君子科植物诃子的干燥幼果。

1.2 仪器与设备

UV-2100型紫外-可见分光光度计：美国珀金埃尔默股份有限公司；Fluoroskan ascent FL荧光光度计：美国赛默飞世尔科技公司。

1.3 试剂

没食子酸、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：美国Sigma公司；荧光素钠、2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二盐酸盐（AAPH）：阿拉丁试剂网；L-抗坏血酸（VC）、福林-酚试剂、甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇：国药集团化学试剂有限公司，所有试剂均为分析纯。

2 试验方法

2.1 西青果多酚提取工艺流程

西青果→打粉过筛→甲醇加热回流→抽滤浓缩→石油醚脱脂→乙酸乙酯萃取3次→正丁醇萃取3次→分别浓缩蒸干→加水重悬→过AB-8大孔树脂柱→水洗弃去→分别用20%、60%、80%、95%乙醇洗脱收集→浓缩冻干成粉末

2.2 西青果多酚提取工艺优化

采用单因素试验和正交试验设计进行优化。单因素为甲醇溶液体积分数、提取温度、料液比和提取时间[13-14]。分别计算出各条件下多酚的提取量，在单因素试验的基础上，采用正交试验进一步优化，试验设计如表1所示。

2.3 西青果多酚提取量的测定

采用福林-酚法测定[15]。准确称取0.012 5 g没食子酸，用体积分数为60%的乙醇溶液溶解并定容至250mL，得到没食子酸标准液质量浓度为0.05（mg/mL）。分别吸取 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1 mL 于10 mL具塞比色管中，分别加入福林-酚试剂1 mL，摇匀后再分别加入质量分数12%碳酸钠溶液2 mL，摇匀，室温下避光反应2 h后，在765 nm波长下测定吸光度。平行3组，以试剂空白作参比溶液，以没食子酸质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

表1 正交试验因素与水平Table 1 Factors and their coded levels used for orthogonal array design

取各西青果多酚提取液1.0 mL，置于10 mL具塞比色管中，分别加入福林-酚试剂1 mL和质量分数12%碳酸钠溶液2 mL，摇匀，室温下避光反应2 h后，在765 nm波长下测定吸光度。并根据没食子酸标准曲线来计算提取液中总多酚的含量。

2.4 抗氧化活性检测

2.4.1 DPPH自由基清除率测定

用甲醇溶液配制待测样品，配成浓度分别为0、1、5、10、20、30、40、50 μg/mL，取 3 mL 不同浓度样品溶液，加入3 mL 0.004%DPPH甲醇溶液，充分混匀，室温下避光静置30 min，517 nm波长测吸光度，以等体积甲醇替代DPPH溶液为空白组，以甲醇代替提取液为对照组，VC作阳性对照[16]。

清除率/%=[1-（Ai-Aj）÷ Ao]× 100

式中：Aj为空白组吸光度；Ai为样品吸光度；Ao为对照组吸光度。

2.4.2 ABTS法测定抗氧化能力

ABTS+自由基清除活性测定使用ABTS总抗氧化能力评价方法。ABTS在氧化剂的作用下生成绿色的ABTS+·，在抗氧化物存在时ABTS+·会被抑制。使用前12 h～16 h将ABTS反应原液与过硫酸钾混合，用PBS稀释调整在734 nm吸光度为0.70±0.05。添加 200 μL 混合液和 10 μL 样品溶液，2 min～6 min后在734 nm测量吸光度，以VC为阳性对照，以蒸馏水为空白组对照[17]。

清除率/%=[1-（Aj-Ai）÷ Ao]× 100

式中：Aj为空白组吸光度；Ai为样品吸光度；Ao为对照组吸光度。

2.4.3 样品总还原力的测定

分别取 1 mL 浓度为 1、5、10、50、100、200、400（μg/mL）的各待测样品溶液，加入0.2 mL浓度为0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 6.6）和1.5 mL的0.3%K3[Fe（CN）6]溶液，50 ℃水浴 20 min，迅速冷却，加入1mL的10%三氯乙酸，混匀后10000r/min离心10 min。取2 mL上清液依次加入3 mL的蒸馏水和0.5 mL的0.3%三氯化铁，摇匀，在700 nm测定吸光值，以蒸馏水为空白对照，VC为阳性对照[18]。

1.3.4.4 ORAC法测定抗氧化能力

ORAC也被成为抗氧化能力指数，荧光素钠与过氧化氢自由基作用后荧光强度会衰减，以trolox作为抗氧化物标准物质，以蒸馏水为空白对照。用75 mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH 7.4）配制荧光素钠溶液和AAPH溶液（153 mmol/L），现配现用，避光，配制浓度为 2.5、5、10、25、50、100、150、200 μg/mL的待测样品溶液。在96孔荧光板中加入50 μL的待测样品、100 μL的荧光素钠溶液和 50 μL的AAPH溶液。在37℃、485 nm激发波长、538 nm发射波长条件下，每隔3 min检测荧光强度，持续120 min，通过时间和荧光强度变化计算各样品的ORAC值，即Trolox当量值[19-20]。荧光衰退曲线下的净面积（AUC）采用近似积分法计算，AUC=3×（f0+f1+…+fn）-1.5×（f0+fn），fn为第 n 个测定点的相对荧光光强度。待测样品的ORAC值具体计算公式表示为

ORAC值=（AUCi-AUCo）/（AUCtrolox-AUCo）

式中：AUCi为样品吸光度；AUCo为空白组吸光度。

2.5 数据统计分析

统计学分析用SPSS19.0软件进行，试验结果以平均值±标准差表示，各组结果采用LSD显著性差异测验进行单向方差分析，显著水平为0.05，极显著水平为0.01。

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果

3.1.1 料液比对多酚提取量的影响

准确称取西青果粉末6份，料液比分别为1∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL），用 60%甲醇溶液提取2 h，提取温度60℃。料液比对多酚提取量的影响见图1。

图1 料液比对多酚提取量的影响Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction efficiency of polyphenols

由图 1可知，在料液比为 1∶20（g/mL）时，多酚提取率达到最大值51.61 mg/g，随后逐渐减小。可能原因当粉末的量过多时，只有部分多酚溶出，当甲醇的体积到足够大时，多酚可以全部溶出，随着甲醇体积的不断增大，一些醇溶性杂质也会被提取出来，从而使多酚的含量有所下降，导致多酚提取率逐渐减小直至稳定。

3.1.2 甲醇溶液体积分数对多酚提取量的影响

按料液比1∶20（g/mL）准确称取西青果粉末7份，分别加入到甲醇溶液体积分数分别为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的溶剂中，提取2 h，提取温度60℃。甲醇溶液体积分数对多酚提取量的影响见图2。

图2 甲醇溶液体积分数对多酚提取量的影响Fig.2 Effect of methanol concentration on the extraction efficiency of polyphenols

由图2可知，当甲醇浓度较低时，一些糖类物质会溶出，降低了多酚的提取率，随着甲醇溶液体积分数增加至50%时，多酚与甲醇溶剂的极性最为接近，多酚的提取率达到最大值39.12 mg/g，当甲醇溶液体积分数过高时，一些脂溶性物质也会溶出，同时甲醇与多酚类物质极性差异变大，这些因素都会影响多酚的提取率。

3.1.3 提取时间对多酚提取量的影响

按料液比1∶20（g/mL）准确称取西青果粉末7份，在 60 ℃恒温水浴中分别提取 1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h，甲醇溶液体积分数50%，提取温度60℃。提取时间对多酚提取量的影响见图3。

图3 提取时间对多酚提取量的影响Fig.3 Effect of extraction time on the extraction efficiency of polyphenols

由图3可知，多酚提取量随提取时间的延长逐渐增大，在2.5 h时达到最大值为43.24 mg/g，随后有所减少。这是由于溶剂与被提取物质接触时间增加，有利于多酚类物质的溶出，当多酚溶出完全时，延长提取时间可能导致部分不稳定的多酚被氧化损失。

3.1.4 提取温度对多酚提取量的影响

按料液比1∶20（g/mL）准确称取西青果粉末6份，分别置于 30、40、50、60、70、80 ℃恒温水浴中，其中，提取时间为2.5 h，甲醇溶液体积分数50%，提取温度60℃。提取温度对多酚提取量的影响见图4。

图4 提取温度对多酚提取量的影响Fig.4 Effect of temperature on the extraction efficiency of polyphenols

由图4可知，多酚提取量随提取温度的增高而逐渐增大，在70℃时达到最大值为47.96 mg/g，随后有所减少。可能原因温度升高，溶剂分子热运动速度加快，提取效率增大，当温度过高时，多酚容易被氧化甚至产生降解，因此不宜用过高的温度来提取多酚类物质。

3.2 正交试验设计及结果

正交试验设计及结果见表2。

表2 正交试验设计及结果Table 2 Orthogonal array design with experimental results

根据单因素试验结果，设计了四因素三水平L9（34）正交试验，考察结果用多酚提取量来表示，正交试验结果如表所示，影响多酚提取效果的四因素主次顺序为D＞A＞B＞C，即提取温度＞料液比＞甲醇体积分数＞提取时间；提取最佳工艺条件为A2B2C1D2，即甲醇溶液体积分数50%，提取时间2 h、提取温度70℃、料液比1∶20（g/mL）。按照正交试验最佳提取工艺条件进行提取，多酚粗提物提取量为54.12mg/g，提取效率高于以上9个试验组合，正交试验最佳工艺条件得以验证。

3.3 提取最佳工艺验证及过柱纯化后各组分总多酚含量

取100 g的西青果粉末，按照最佳提取工艺提取一批西青果多酚的粗提液，经过萃取和柱纯化后，正丁醇萃取部分和乙酸乙酯萃取部分各洗脱级份多酚含量如表3所示，其中20%～60%乙醇洗脱部分的西青果多酚含量最高，分别达到71%和72%，因此采用20%～60%乙醇洗脱部分来研究西青果多酚的抗氧化能力。

表3 乙醇分级洗脱组分中多酚含量Table 3 Polyphenol content in elution composition with different concentrations ethanol

3.4 抗氧化能力评价

3.4.1 DPPH自由基清除能力

同质量浓度西青果多酚对DPPH自由基清除效果见图5。

图5 不同质量浓度西青果多酚对DPPH自由基清除效果Fig.5 DPPH free radical scavenging effect of polyphenols from Fructus terminaliae immaturus at different concentrations

由图5可知，西青果多酚和VC都有清除DPPH自由基的作用。随着多酚提取物和VC质量浓度的增大，对DPPH自由基的清除能力均先增强最后趋于恒定。在浓度＜30 μg/L时，乙酸乙酯和正丁醇萃取西青果多酚的DPPH自由基清除能力均显著强于VC（P＜0.05）。当浓度＞30 μg/L时，3种物质对DPPH自由基基本清除完全。通过计算正丁醇萃取部分IC50值为3.483 μg/L，乙酸乙酯萃取部分IC50值为 3.151 μg/mL，VCIC50值为 5.521 μg/mL，说明西青果多酚具有比VC更强的清除DPPH自由基能力。本方法采用的VC纯度为97%，而经过萃取和纯化的西青果多酚具有更强的DPPH自由基清除能力，因此应当选取抗氧化能力比VC更强的物质作为阳性对照。

3.4.2 ABTS法测定抗氧化能力

不同质量浓度西青果多酚对ABTS+自由基清除效果见图6。

图6 不同质量浓度西青果多酚对ABTS+自由基清除效果Fig.6 ABTS+free radical scavenging effect of polyphenols from Fructus terminaliae immaturus at different concentrations

由图6可知，当浓度＜75 μg/mL时，乙酸乙酯和正丁醇萃取西青果多酚对ABTS+自由基清除能力与VC无显著性差异，但当浓度＞75 μg/mL，乙酸乙酯部分的西青果多酚对ABTS+自由基清除能力显著大于正丁醇萃取西青果多酚（P＜0.05）和VC（P＜0.05），当浓度增大到400 μg/mL时，3种物质对ABTS+自由基基本清除完全。通过计算正丁醇萃取部分IC50值为 76.774 μg/mL，乙酸乙酯萃取部分 IC50值为53.977 μg/mL，VC的 IC50值为 76.337 μg/mL，结果显示乙酸乙酯萃取部分的西青果多酚具有更强的清除ABTS+自由基能力。分析原因是正丁醇的极性大于乙酸乙酯，不同极性溶剂萃取出来的各多酚物质的种类和相对含量有所差异，因此两者的抗氧化能力也有差异。经过乙酸乙酯萃取和纯化的西青果多酚具有比VC更好的清除ABTS+自由基能力，因此应当选取抗氧化能力更强的物质代替VC作为阳性对照。

3.4.3 总还原能力的测定

不同质量浓度西青果多酚的总还原能力见图7。

图7 不同质量浓度西青果多酚的总还原能力Fig.7 Total reduction force of polyphenols from Fructus terminaliae immaturus at different concentrations

由图7可知，西青果多酚和VC的总还原力均随着浓度的增大而增加，正丁醇和乙酸乙酯萃取的西青果多酚均显著高于VC的还原力（P＜0.05），当浓度＞50 μg/mL时，正丁醇和乙酸乙酯萃取的西青果多酚的总还原力相当。说明西青果多酚的总还原力强于VC，这从另一方面也表明了西青果多酚较强的抗氧化能力，与其他的几种抗氧化能力评价方法结果相符合。

3.4.4 ORAC法测定抗氧化能力

不同质量浓度西青果多酚的ORAC值见图8。

图8 不同质量浓度西青果多酚的ORAC值Fig.8 ORAC value of polyphenols from Fructus terminaliae immaturus at different concentrations

根据曲线下面积和浓度之间的关系，得到标准物Trolox 的标准曲线 y=1.203 1x+3.470 3，R2=0.988 4，通过与标准物Trolox的曲线进行对比，得到了西青果多酚和VC的ORAC值。ORAC值越大，说明单位浓度下换算成的Trolox的量也越大，即抗氧化能力越强。由图可知，随着浓度的增大，3种物质的ORAC值随之增大，当浓度较低时，正丁醇萃取的西青果多酚ORAC值最低，当浓度增加到10 μg/mL时，两种西青果多酚的抗氧化能力均大于VC，浓度增加到最大50 μg/mL时，VC、正丁醇和乙酸乙酯萃取部分的ORAC分别达到0.98、1.41、1.28 μmol/g（即与每g质量的trolox具有同等抗氧化能力的物质的量），其中乙酸乙酯萃取的西青果多酚在不同浓度条件下始终保持着最高的ORAC值。结果表明乙酸乙酯萃取的西青果多酚具有较强的抗氧化能力，与以上3种抗氧化能力评价结果想符合。

4 讨论与结论

在西青果多酚的提取过程中，用甲醇溶液体积分数50%、提取时间2 h、提取温度70℃、料液比1∶20（g/mL）的工艺条件，可以使多酚提取量达到最大值54.12 mg/g。在用大孔树脂纯化粗提多酚的过程中，用20%～60%浓度的乙醇洗脱可以得到含量较高的西青果多酚。这种提取方法原料为西青果粉末，提取效率高，因此适用于工业上的大批量生产。

通过DPPH自由基清除能力、ABTS法测定抗氧化能力、FRAP法测定总抗氧化能力、总还原能力的测定、ORAC法测定抗氧化能力等一系列抗氧化能力评价试验，比较了不同溶剂萃取的西青果多酚的抗氧化活性，综合结果表明经过萃取和纯化的西青果多酚均具有良好的抗氧化活性，其中乙酸乙酯萃取部分的西青果多酚的效果最好。由于不同极性的溶剂萃取出的多酚物质种类也不相同，从而导致了抗氧化活性的差异。可以将西青果多酚开发为优良的天然抗氧化物质，有利于提高西青果中多酚的综合利用价值，为进一步深入研究西青果的功效活性提供理论依据。

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