天然枸杞酵素发酵的代谢产物分析

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

枸杞（Lycium barbarum L.）属茄科枸杞属的木本植物，又名贡血杞子、枸杞豆，为名贵的中药材和高级滋补药品。我国枸杞资源丰富，主要分布在宁夏、新疆、内蒙古、河北等省区，全国年总产量接近1亿万吨[1]。枸杞味甘、性平，富含蛋白质、脂肪、多糖、胡萝卜素、维生素B1、维生素B2、多种氨基酸，具有补肾益精、养肝明目、润肝止咳等功效，有降低胆固醇，减轻动脉硬化，降低血糖等作用[2]。近年来，随着人们对养生保健的重视，枸杞作为我国药食同源的一种宝贵资源深受人们喜爱，其产品的开发已经成为食品加工业研究的热点。

酵素也称“酶”，由蛋白质构成，是一种生物催化剂。酵素是水果或蔬菜在多种有益菌的自然条件下发酵产生，含有丰富的纤维素、酶、矿物质和次生代谢产物等营养成分，具有抗衰、抗菌消炎、净化血液、增强机体免疫力等多种保健功能[3]。酵素几乎参与所有的身体活动，在它的参与下人体维持正常的新陈代谢、自身免疫、修复组织等生理功能，被称之为“活着的物质”、“掌握所有生命活动物质”。随着年龄增长，体内酵素相对减少，适当补充酵素可维持良好的身体状态。

本文以枸杞为主要材料，对枸杞酵素发酵过程中的发酵特性和风味物质进行了分析，研究了枸杞在自然发酵后总酚含量、羟自由基、还原力、DPPH自由基和超氧阴离子自由基清除能力的变化情况，为枸杞产品的综合开发提供参考和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

宁夏农林科学院枸杞研究所提供的宁杞1号干果[4]。氢氧化钠、葡萄糖、3，5—二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、结晶酚、亚硫酸钠、碘、碘化钾、酚酞、乙醇、氯化氢、没食子酸、福林酚试剂、碳酸钠、硫酸亚铁、水杨酸、过氧化氢、Tris、邻苯三酚、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、DPPH均为分析纯。

1.2 仪器与设备

JJ300电子天平：美国双杰（兄弟）集团有限公司；TCL-16M高速台式冷冻离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；JYL-C010榨汁机：青岛九阳世家电器有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；MP522型精密pH/电导率测量仪：上海三信仪表厂；PAL-1糖度计：日本爱拓公司；GCMS-QP2010 Ultral气质联用仪：日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞酵素的制备[5]

宁杞1号干果与水1∶5（g/mL）混合加入到无菌玻璃瓶中，密封常温下发酵，以上步骤均在无菌操作台中进行。发酵开始后，每5天为一阶段取样，样品8 000 r/min冷冻高速离心10 min后进行各项指标测定。

1.3.2 枸杞酵素pH值的测定

pH值利用pH计测得。

1.3.3 枸杞酵素可滴定酸的测定、

可滴定酸按照GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定》测得。

1.3.4 枸杞酵素可溶性固形物含量的测定

固形物含量利用糖度计测得。

1.3.5 枸杞酵素还原糖与总糖含量的测定

还原糖与总糖含量采用3，5-二硝基水杨酸法测得。

1.3.6 枸杞酵素挥发性风味物质的测定[6]

取5 mL样品于萃取瓶中，60℃水浴恒温加热，吸附萃取40 min，进样口解吸15 min。

Rtx-5MS30.0 m×250 μm×0.25 μm 毛细血管；程序升温：初始温度40℃，保持3 min，以4℃/min升至150℃，保持1 min，再以8℃/min升至250℃，保持6min。进样口温度250℃，进样方式：分流，分流比：10 ∶1，载气为 He，纯度 99.99%。电离方式：EI，离子源温度200℃，传输线温度220℃；扫描方式：全扫描，扫描范围 30～550（m/z），溶剂延迟时间 1.5 min。

检测结果载NIST谱库检索，将匹配度大于80%的化合物作为暂定结果，并查阅资料进行结果比对，以确定最终检测结果。

1.3.7 枸杞酵素总酚含量的测定[7]

取样品0.5 mL，补蒸馏水至6 mL，加入福林酚试剂0.5 mL，摇匀静置反应3 min，添加20%的碳酸钠溶液1.5 mL，充分混合后定容，30℃避光放置30 min后，在760 nm处测定吸光度，以蒸馏水为空白对照。枸杞酵素中总酚含量以没食子酸等价物来表述，按照标准曲线线性方程y=1.756 1x+0.121 2（R2=0.989 65）来计算酵素中总酚含量，其中y代表吸光度值；x代表样品浓度。

1.3.8 枸杞酵素羟基自由基清除能力测定

采用水杨酸比色法[8]。准确移取100、200、400、600、800、1 000、1 200、1 400、1 600、1 800 μL 待测样液于10 mL试管中，用蒸馏水稀释至2 mL。依次加入9 mmol/L硫酸亚铁1 mL、9 mmol/L乙醇-水杨酸1 mL，混合均匀后，加入8.8 mmol/L双氧水溶液启动反应，37℃水浴加热30 min，510 nm下测定样液的吸光度值。

式中：A0为空白对照液的吸光度；A1为样品测定管的吸光度；A2为样品本底管的吸光度。

1.3.9 枸杞酵素超氧自由基清除能力测定

采用邻苯三酚自氧化法[9]。准确移取100、200、400、600、800、1 000、1 200、1 400、1 600、1 800 μL待测样液于10mL试管中，用去离子水稀释至4.2mL。加入0.05 mol/LpH7.4Tris-HCl缓冲液4.5 mL，混合均匀后，25℃水浴加热20 min。取出样品，迅速加入去离子水0.3mL和60mmol/L邻苯三酚溶液0.3mL，混合均匀后反应5 min，在325 nm处测定吸光度，计算清除率。

式中：A0为邻苯三酚自氧化的吸光度；A1为加入样液后邻苯三酚自氧化的吸光度。

1.3.10 枸杞酵素还原力测定

采用铁氰化钾法[10]测定还原力。准确移取10、20、40、60、80、100、120、140、160、180 μL 待测样液于10 mL试管中，用去离子水稀释至1 mL。加入0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH6.6）1 mL和1%的铁氰化钾溶液1 mL，置于50℃水浴中反应20 min后加入10%三氯乙酸溶液1mL，混合物在4000r/min条件下离心10min。吸取上清液2mL，加入2mL蒸馏水和0.1%三氯化铁溶液400μL，在700nm处测其吸光度值，反应物的吸光度值越大表明还原力越强。

1.3.11 枸杞酵素DPPH自由基清除能力测定

准确称取20mgDPPH，用无水乙醇定容于250mL容量瓶中，得到浓度为20 mmol/L的DPPH溶液。移取 10、20、40、60、80、100、120、140、160、180 μL 待测样液于试管中，用去离子水稀释至2 mL。将稀释后的样液与2 mLDPPH溶液混合后反应30 min，待测波长517 nm吸光度的变化，对照溶剂用无水乙醇代替。

式中：A1为2 mLDPPH溶液与2 mL提取液的吸光度；A2为2 mL提取液与2 mL无水乙醇的吸光度；A3为2mLDPPH溶液与2mL无水乙醇的吸光度。

2 结果与分析

2.1 枸杞发酵过程中的理化指标测定

2.1.1 发酵过程中pH值的变化

pH值表示样品中呈离子状态的氢离子的浓度，pH值的变化可以反应发酵过程是否正常见图1。从图1可以看出，在0～20 d，发酵液pH值随着发酵时间的延长而逐渐降低，pH值从4.98降到3.63。到25 d稍有回升，之后趋于平稳。由于枸杞本身具有柠檬酸等酸性物质，枸杞液初始pH值为酸性。酵液中的微生物利用自身代谢使枸杞中的碳水化合物成有机酸、二氧化碳等物质，使得酵液pH值降低[11]。随着发酵进入缓慢发酵阶段，酵液中微生物对枸杞蛋白的降解利用，使得pH值稍有回升。

图1 发酵过程中pH的变化Fig.1 Changes of pH during fermentation

2.1.2 发酵过程中可滴定酸的变化

酸度是衡量枸杞发酵成熟度的主要指标，同时也是反应枸杞发酵液品质的重要理化指标见图2。从图2可以看出，在发酵前期微生物通气发酵阶段，代谢生成的二氧化碳和有机酸使得可滴定酸逐步升高。在发酵20 d后，发酵液的可滴定酸快速升高，由于在溶氧不足的情况下，微生物将酒精转化为乙酸，己糖转化为乳酸等有机酸[12]。这些有机酸既提高了枸杞发酵液的营养物质，又形成了枸杞发酵液独特的风味，还具有一定的抑菌效果，对枸杞发酵液的生产具有重要影响。

图2 发酵过程中可滴定酸的变化Fig.2 The change of titratable acid during fermentation

2.1.3 发酵过程中可溶性固形物的变化

碳水化合物是微生物生长的重要营养因子见图3。由图3可以看出，随着发酵时间的延长，可溶性固形物含量呈现不断下降的趋势。由于发酵液营养充分，环境适宜，微生物快速繁殖，不断消耗碳水化合物，使得发酵液中可溶性固形物逐渐减少[13]。

图3 发酵过程中可溶性固形物的变化Fig.3 the change of soluble solids in the fermentation process

2.1.4 发酵过程中糖含量的变化

糖是微生物发酵重要的碳源，发酵过程中糖含量的变化见图4。如图4所示，在发酵0～5 d内，还原糖呈上升趋势，随后缓慢下降，在发酵35 d后趋于稳定，而总糖在发酵过程中逐渐减少，在10 d～15 d下降最快，在35 d后趋于平稳。从图4中分析，发酵初期优势菌种在转化酶作用下将糖转化为葡萄糖、果糖，发酵液中的还原糖增加。到发酵中期其中一部分微生物将糖转化为有机酸，还原糖逐渐减少。从图中可以看出，总糖含量始终高于还原糖，说明在枸杞液中含有非还原性的多糖[14]。发酵35 d后，总糖和还原糖均处于最低水平，说明发酵已经结束。

图4 发酵过程中糖含量的变化Fig.4 Changes in sugar content during fermentation

2.2 发酵前后枸杞液风味物质的测定

未发酵枸杞液GC-MS总离子流色谱见图5，枸杞酵素GC-MS总离子流色谱见图6，未发酵枸杞的挥发性

成分的GC-MS分析结果见表1，枸杞酵素的挥发性成分的GC-MS分析结果见表2。

图5 未发酵枸杞液GC-MS总离子流色谱Fig.5 GC-MS total flow chromatography of non fermented Lycium barbarum L.liquid

图6 枸杞酵素GC-MS总离子流色谱Fig.6 Total GC-MS ion chromatography of Lycium barbarum L.

表1 未发酵枸杞的挥发性成分的GC-MS分析结果Table 1 GC-MS analysis results of volatile components in non fermented Lycium barbarum L.

表2 枸杞酵素的挥发性成分的GC-MS分析结果Table 2 GC-MS analysis results of volatile components in Lycium barbarum L.enzyme

续表2 枸杞酵素的挥发性成分的GC-MS分析结果Continue table 2 GC-MS analysis results of volatile components in Lycium barbarum L.enzyme

续表2 枸杞酵素的挥发性成分的GC-MS分析结果Continue table 2 GC-MS analysis results of volatile componentsin Lycium barbarum L.enzyme

香气成分是构成发酵产品风味的主要指标，是多种挥发性物质共同作用的结果。采用固相微萃取-气质联用的技术分析研究枸杞发酵前后的风味物质。从表1可以看出，未发酵枸杞液中共检测出32种成分，1种酯类、12种醛类、8种酮类、11种醇类。未发酵的枸杞液醇类、醛类物质含量高，对未发酵枸杞液的风味贡献大。如壬醛具有强烈的油脂气味和甜橙气息，己醛具有天然的水果香气及青草、油脂气味。1-戊烯-3-醇、己醇、1-辛醇、1-壬醇、3-甲基-1-丁醇赋予枸杞一种令人愉快的气味，如1-戊烯-3-醇是存在于橙子、草莓、番茄等水果中的一种果香。酮类使枸杞液表现出独特的风味，如2，3-丁二酮具有浓郁的奶油味。

由表2可以看出，天然发酵后得到的枸杞酵素利用GC-MS分离鉴定出64种化合物，主要的挥发物质包括20种酯类、9种醛类、6种酮类、23种醇类、3种酸类、3种芳香杂环类。

共检测出的酯类物质含量达25.25%。酯类物质具有成熟果香味或坚果味，对酵素的整体风味具有促进作用。如乙酸乙酯赋予花香和果香味，正癸酸乙酯具有椰子香型香气，月桂酸乙酯是良好的食用香精香料添加剂。

共检测出的醛类物质含量达9.9%。醛类是枸杞酵素的主要风味成分，赋予酵素独特的花香、果香味。如苯乙醛能够赋予发酵饮料甜香和果味，壬醛具有强烈的油脂气味和甜橙气息。3-甲基丁醛具有苹果香味，苯甲醛具有特殊的杏仁气味，都是食用香料。

共检测出的酮类物质含量达3.18%。酮类物质经过不饱和脂肪酸或氨基酸氧化、降解或是在发酵过程中代谢产生，赋予酵素独特的风味。如3-羟基-2-丁酮具有浓郁的奶油味，3-辛烯-2-酮具有植物芳香的气味。

共检测出的醇类物质含量达25.83%。乙醇是枸杞天然发酵的主要风味物质之一，正己醇具有果子香气，1-辛烯-3-醇具有蘑菇、薰衣草、玫瑰和甘草香气，苯乙醇具有清甜的玫瑰样花香。

共检测出的酸类物质含量达26.38%。4-甲基-2-氧代戊酸是枸杞天然发酵的主要风味之一，赋予香甜的口感，是一种重要的食用香料。

共检测出的杂环类物质含量达7.74%。呋喃类化合物主要是糖与氨基酸发生美拉德反应，具有水果香、焦糖香、烤香味，是发酵产品的重要风味物质。2-乙酰基呋喃呈杏仁、坚果、酵香、牛奶和甜的焦糖似香气，2-正戊基呋喃呈豆香、果香、类似蔬菜的香气，4-乙基苯酚呈强烈木-酚气息，有轻微香甜香气。

其余成分是烷烃类物质，相对含量较少。烷烃类的香气较弱，对酵素风味贡献不大。

2.3 枸杞酵素抗氧化性测定

2.3.1 发酵前后的枸杞液总酚含量的测定结果

枸杞中的酚类物质是一类重要的抗氧化物质，按照上述方法测定，对发酵前后枸杞液的总酚含量进行了测定见图7。如图7所示，未发酵枸杞液的总酚含量为（1.738±0.035）mg/mL，发酵后枸杞酵素的总酚含量为（1.926±0.042）mg/mL，发酵后总酚含量明显增加。枸杞自然发酵后，微生物快速繁殖，酚类物质随着碳源氮源的消耗而释放出，枸杞中复杂的大分子酚类物质转化成小分子酚类物质，使得总酚含量增加[15]。

图7 发酵前后的枸杞液总酚含量的测定结果Fig.7 Determination of total phenolic content in Lycium barbarum L.liquid before and after fermentation

2.3.2 发酵前后的枸杞液羟基自由基清除能力测定结果

发酵前后的枸杞液羟基自由基清除能力测定结果见图8。

图8 发酵前后的枸杞液羟基自由基清除能力测定结果Fig.8 Determination results of hydroxyl radical scavenging ability of Lycium barbarum L.liquid before and after fermentation

从图 8可知，样液体积在 100 μL～800 μL 内，发酵前后的枸杞液对羟基自由基清除能力随样液浓度增加而增强。样液体积为1 000 μL时，枸杞酵素对羟基自由基的清除率为（91.12±0.78）%，未发酵枸杞液为（81.87±3.35）%。枸杞酵素对羟基自由基的清除能力明显提高。之后随浓度的增加，未发酵枸杞液和枸杞酵素对羟基自由基清除能力无明显提升。分析原因可能是微生物在发酵过程中产生了一些例如SOD等抗氧化酶类，清除活性氧，使得发酵后的枸杞液的抗氧化能力提高[16]。

2.3.3 发酵前后的枸杞液超氧自由基清除能力测

发酵前后的枸杞液超氧自由基清除能力测见图9。

图9 发酵前后的枸杞液超氧阴离子自由基清除能力测定结果Fig.9 Determination results of superoxide anion radical scavenging ability of Lycium barbarum L.liquid before and after fermentation

从图9可以得出，发酵前后的枸杞液对超氧阴离子自由基有一定的清除能力，随样液浓度的增加而增强。样液体积为180 μL时，枸杞酵素对超氧自由基清除率为（89.95±3.32）%，未发酵枸杞液为（39.57±2.77）%。结果表明未发酵枸杞液与枸杞酵素的超氧自由基清除率随浓度的增加而增加，枸杞酵素的抗氧化能力明显提高。枸杞酵素之所以能够清除超氧阴离子自由基主要因为多酚类物质分子中含有大量的酚羟基，能提供活泼的氢，从而终止自由基连锁反应，起到抗氧化的作用。

2.3.4 发酵前后的枸杞液还原力测定结果

发酵前后的枸杞液还原力测定结果见图10。

图10 发酵前后的枸杞液还原力测定结果Fig.10 Results of force determination of Lycium barbarum L.before and after fermentation

从图 10 可知，样液体积在 100 μL～1 200 μL内，未发酵枸杞液与枸杞酵素的还原力随样液的浓度增加而增强。样液体积为1 400 μL时，枸杞酵素在700 nm处的吸光度为1.425±0.089，未发酵枸杞液为1.164±0.101。枸杞酵素的还原力显著提高。之后随着样液浓度的增加，还原力均无明显提高[17]。

2.3.5 发酵前后的枸杞发酵液DPPH自由基清除能力测定结果

发酵前后的枸杞发酵液DPPH自由基清除能力测定结果见图11。

图11 发酵前后的枸杞液DPPH自由基清除能力测定结果Fig.11 Determination results of DPPH free radical scavenging ability of Lycium barbarum L.liquid before and after fermentation

DPPH自由基是一种以氮源子为中心能稳定存在的自由基，通过检测样品对DPPH自由基的清除能力表示其抗氧化性的强弱。从图11可知，DPPH自由基清除能力随着样液浓度的增加而提高。未发酵枸杞液的DPPH自由基清除率达到64.31%±1.65%，枸杞酵素的DPPH自由基清除率为92.34%±1.84%，枸杞酵素的DPPH清除能力提高较多，清除率提高了28.03%。枸杞发酵过程中逐渐释放出酚类物质，酚类物质具有较强的抗氧化性，使得枸杞酵素抗氧化性增强[18]。

3 结论

本研究以枸杞为原料，经过枸杞自身固有的多种有益菌自然条件下发酵45 d。检测枸杞发酵过程中的pH值、可滴定酸、可溶性固形物、还原糖和总糖的含量，利用固相微萃取-气质联用的技术分析发酵前后风味物质成分，以及对枸杞酵素主要抗氧化物质含量进行检测。结果表明：pH值一直降低，最后保持在3.6～3.9之间；可滴定酸一直增加，发酵结束后达到8.14%；可溶性固形物不断减少，最后保持8.0～8.5之间；总糖逐渐减少，还原糖先升后降，最后均低于0.5%。枸杞经天然发酵后，风味物质发生明显变化，在有益菌转换下生成了20种酯类、9种醛类、6种酮类、23种醇类、3种酸类、3种芳香杂环类，赋予了酵素特殊的发酵香气。枸杞酵素具有良好的抗氧化性，总酚含量、羟基自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力、还原力、DPPH自由基清除能力均明显高于未发酵枸杞，且随酵素浓度增加而增强。本研究可为枸杞发酵产品的研发提供一定的数据参考。为枸杞酵素的多功能开发利用提供理论基础。

[1]徐常青,刘赛,徐荣.我国枸杞主产区生产现状调研及建议[J].中国中药杂志,2014,39(11):1979-1984

[2]张静,辛力,王淑贞,等.枸杞复合保健饮料工艺研究[J].保鲜与加工,2002,2(4):23-24

[3]毛建卫,吴元锋,方晟.微生物酵素研究进展[J].发酵科技通讯,2010,39(3):42-44

[4]郭红莲,宋巍,颜国政,等.宁夏枸杞干果污染菌相调查与防控措施[J].食品研究与开发,2011,32(5):153-155

[5]Larrauri j A,Snchezmoreno C Sauracallixto.Effect of temperature on the free radical scavenging capacity of extracts from red and white grape peels[J].Agric Food Chem,1998,46(7):2694-2697

[6]林晓姿,梁璋成,魏巍.益生菌豆乳发酵剂的筛选[J].中国乳业工业,2011,39(8):11-15

[7]Dalene de Beer,Elizabeth Joubert,Wentzel C A Gelderblom,et al.Antioxidant activity of south African red and white cultivar wines:Free radical scavenging[J].Jouranal of Agricultural and Food Chemistry,2003,51(4):902-909

[8]Chen N,Yang H M,Sun Y,et al.Purification and identification of peptides from walnut(Juglans regia L.)protein hydrolysates[J].Peptides,2012,38(2):344-349

[9]田志琴.小米多酚类活性物质的提取及抗氧化性研究[D].郑州:河南工业大学,2011

[10]Yu-Hsiu Tseng,Joan-Hwa,Hui-Ling chang,et al.Antioxidant properties of menthenolic extracts from monascal adlay[J].Food Chemistry,2006,97:375-381

[11]Jayabalan R,Subathradevi P,Marimuthu S,et al.Changes in freeradical scavenging ability of kombucha teaduring fermentation[J].Food Chemistry,2008,109(1):227-234

[12]侯占群,文剑,吴逸民.谷物饮料关键制备技术及其稳定性研究进展[J].食品与发酵工业,2012(10):146-150

[13]徐春丽.鲜甜玉米、大豆乳酸发酵饮料的研制[D].沈阳:沈阳农业大学,2016

[14]陈英,余雄伟,龚文发,等.植物酵素发酵特性及风味物质变化的研究[J].饮料工业,2015,18(2):9-12

[15]Chu S C,Chen C.Effects of origins and fermentation time on the antioxidant activities of kombucha[J].Food Chemistry,2006,98(3):502-507

[16]刘洋,郭宇星,潘道东.4种乳酸菌体外抗氧化能力的比较研究[J].食品科学,2012,33(11):25-29

[17]郭松年.石榴汁花色普稳定性、抗氧化性及其组分鉴定[D].杨凌:西北农林科技大学,2008

[18]郭艳萍,赵金安.葡萄酵素天然发酵过程中抗氧化性能研究[J].食品研究与开发,2016,37(10):35-38