过表达miRNA-125b促进肺癌细胞A549的增殖、侵袭能力及其机制研究

张华勇，韩 强，李俏敏，钟北龙

(中山大学附属第五医院：1.胸心外科；2.麻醉科，广东珠海 519000)

近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和病死率均明显升高，肺癌已经是我国死亡率第1位的恶性肿瘤，严重危害人民群众的身体健康[1]。肺癌患者早期诊断较为困难，故多数患者在就诊时已经处于肿瘤中晚期，预后较差。微小RNA(microRNAs,miRNA)是一类小分子的非编码单链RNA，长度为20～24个核苷酸，具有广泛的生物功能：人类约1/3的基因的表达受miRNA调节，过程包括早期发育、细胞增殖、细胞凋亡及脂肪酸的代谢[2-3]。越来越多的研究证明miRNA与多种肿瘤的发生、发展具有密切的相关性，其中miRNA-125b在口腔癌及子宫内膜癌等肿瘤组织中明显升高，并能通过多种机制影响肿瘤细胞的增殖、凋亡及侵袭性[4-5]。但miRNA-125b与肺癌的相关性研究较少。作者旨在探讨过表达miRNA-125b促进肺癌细胞A549的增殖、侵袭能力及其机制。

1 材料与方法

1.1材料 实验细胞：正常人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells,HBECs)及人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞A549购自上海天呈医疗科技股份有限公司。主要试剂及仪器：miRNA-125b模拟物、阴性对照(negative control,NC)模拟物购自上海伯豪生物技术有限公司，RPM2-1640培养液及胎牛血清购自美国Gibco公司，噻唑蓝(MTT)及二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司，Gel DoxTM XR+凝胶成像系统购自美国Bio-RAD公司，Bcl-2 调节因子(BMF)及GAPDH抗体、BCA定量及Western blot试剂购自美国Invitrogen公司，RNA提取及PCR试剂购自瑞士Roche公司，PCR引物由宁波康贝生化有限公司合成(miRNA-125b上游引物：5′-GCU CCC UGA GAC CCU AAC-3′，下游引物：5′-CAG TGC AGG GTC CGA GGT-3′；GAPDH上游引物：5′-AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG-3′，下游引物：5′-GGG GTC GTT GAT GGC AAC A-3′)；超净无菌工作台购自德国Spetec公司，细胞培养箱购自美国Thermo公司，低速离心机购自美国Beckman Coulter公司，倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司，酶标仪购自美国Biotek公司，PCR仪购自美国Thermo公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 按3×105个/mL的密度将细胞悬液接种于96孔板培养，于37 ℃，5%CO2培养箱中培养，待细胞面积生长至70%～80%后传代。

1.2.2Q-PCR检测HBECs及A549细胞的miRNA-125b表达水平 按照TrizolTM试剂盒说明书提取HBECs及A549细胞总RNA，测定RNA浓度及纯度，取1 μg总RNA反转录合成cDNA，取5 μL cDNAxo稀释4倍后，取2 μL为模板，分别以目的基因及内参GAPDH的引物进行Q-PCR，反应条件：95 ℃预变性3 s；95 ℃变性10 s；60 ℃退火/延伸30 s，重复 40个循环；65～95 ℃每增加0.5 ℃进行5 s读板，形成溶解曲线。所有样本均设置3个平行管，基因表达量以平行管平均循环阈值(cycle-threshold，Ct)表示，应用2-ΔΔCt法计算并比较两种细胞miRNA-125b表达水平。

1.2.3细胞转染 操作按照miRVanaTmmiRNA步骤进行：将转染液以1∶30的比例加入RPM2-1640无血清培养基中混匀后静置10 min，将miRNA-125b模拟物及NC模拟物分别加入混有转染剂的培养基中混匀，静置10 min后以反应生成复合体。将配置好的复合体铺在96孔板并轻轻晃动，加入3×105个/mL的细胞悬液，混匀后置于培养箱中培养。将A549细胞分为3组：miRNA-125b组(加入miRNA-125b模拟物)，NC组(加入NC模拟物)及空白组(同等体积的混有转染剂的胎牛血清)，采用Q-PCR检测miRNA-125b的转染及表达效率。

1.2.4MTT检测细胞增殖能力 于细胞传代后3、6、12、24、48 h采用MTT检测A549细胞的增殖：各组细胞处理完后去除培养基，加入RPM2-1640培养液(每孔100 μL)及含0.5% MTT的培养液(每孔5 μL)，于37 ℃，5%CO2培养箱中孵育4 h后弃培养液，加入100 μL DMSO原液，振荡10 min，待结晶完全溶解后用酶标仪于490 nm波长处测定吸光度(OD)值，实验重复3次。

1.2.5Transwell小室细胞检测细胞侵袭能力 采用小室法检测细胞侵袭力：使用PBS将50 mg/L的Matrigel胶按照1∶8的比例稀释后包被Transwell小室底部膜的上室面(每孔100 μL)，4 ℃风干后吸出残存液体。按照每孔1×104的密度将3组A549细胞接种于处理好的上室中，在下室中加入500 μL 10%胎牛血清的培养基中培养24 h。用PBS洗去残留培养基，4%的多聚甲醛固定过夜后洗去甲醛，HE染色后洗去染色液。侵袭能力评价依照过膜细胞数：在300倍镜下选择小室中央区域，随机挑选5个视野并计数，求平均值。

1.2.6miRNA-125b靶基因检测 采用targetscan(http://www.targetscan.org)根据3′-UTR预测miRNA-125b的靶基因为BMF，Western blot检测3组A549细胞的BMF表达水平：按照说明书用蛋白裂解液(含磷酸酶抑制剂)裂解30～60 min，4 ℃，12 000×g离心5 min获取总蛋白，BCA法测浓度后各取30 μg蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳，100 V恒压转膜60～90 min；5%脱脂奶粉/TBST室温封闭1～2 h，BMF(抗体1∶500)抗体4 ℃孵育过夜；1∶5 000 β-actin室温孵育90 min，TBST洗膜10 min×3次，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔/鼠二抗室温孵育2 h，TBST洗膜10 min×2次，TBS洗膜5 min，ECL发光试剂盒色，显影，Gel DOXTM XR+凝胶成像系统成像，图像分析采用QuantityOne软件，取各条带透光体积与内参条带的比值作为目标蛋白相对表达量，实验重复3次。

2 结 果

2.1HBECs及A549细胞miRNA-125b的表达水平比较 HBECs、A549细胞miRNA-125b的表达水平分别为1.0±0.1、2.7±0.4，与HBECs细胞比较，A549细胞的miRNA-125b表达水平明显上升(t=5.925，P<0.05)，见图1。

a：P<0.05，与HBECs细胞比较

图1两种细胞的miRNA-125b表达水平

2.2各组A549细胞的miRNA-125b表达水平比较 与空白组(1.0±0.2)比较，miRNA-125b组细胞的miRNA-125b(2.9±0.6)表达水平上升(t=6.249，P<0.05)；NC组的miRNA-125b表达水平(1.0±0.1)无明显变化(t=0.172，P>0.05)，见图2。

a：P<0.05，与空白组比较

图2各组细胞的miRNA-125b表达水平

2.3各组A549细胞增殖能力比较 与空白组及NC组细胞比较，miRNA-125b组细胞的增殖能力明显增加(P<0.05)；NC组与空白组细胞的增殖能力比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

a：P<0.05，与空白组比较

图3各组细胞的增殖能力比较

2.4各组A549细胞侵袭能力比较 空白组、miRNA-125b组、NC组过膜细胞数分别为(21.0±4.0)、(28.0±5.0)、(22.0±5.0)个。与空白组比较，miRNA-125b组细胞的侵袭能力上升(t=2.984，P<0.05)；NC组与空白组的侵袭能力比较，差异无统计学意义(t=0.357，P>0.05)。

2.5各组A549细胞的BMF表达水平 与空白组(1.0±0.1)比较，miRNA-125b组细胞的BMF(0.4±0.2)表达水平下降(t=5.921，P<0.05)；NC组的BMF(0.9±0.1)表达水平无明显变化(t=0.285，P>0.05)，见图4。

a：P<0.05，与空白组比较

图4各组细胞的BMF表达水平

3 讨 论

目前，我国肺癌的发生率呈现逐年上升的趋势，其中85%的患者为NSCLC。NSCLC的恶性程度较高，肿瘤进展较快，多数患者在确诊时已经出现转移，患者预后较差[6]。miRNA是一种内源性非编码单链RNA分子，参与转录后基因表达调控。目前为止，动植物及病毒中已经发现有超过20 000个miRNA分子[7]。既往研究发现，多种疾病(心血管疾病、糖尿病及多种恶性肿瘤)患者存在异常的miRNA表达谱系，且miRNA在外周血中的存在较为稳定，多种miRNA在疾病诊断中的价值引起临床上的关注。对miRNA生物学活性的深入了解，以miRNA作为疾病治疗潜在靶点的研究已引起广泛关注[8-9]。

miRNA-125b属于miRNA-125家族，在不同生物学过程中发挥重要作用。miRNA-125b与肿瘤的发生、发展具有密切相关性，miRNA-125b在多种肿瘤组织中表达水平升高，本研究中，与HBECs相比，肺癌细胞A549的表达水平明显上升。既往研究发现，化疗失败的的白血病患者的miRNA-125b水平明显上升，而高表达的miRNA-125b能够有效抑制多种化疗药物引起的白血病细胞凋亡，增强肿瘤细胞的耐药性[10]；但miRNA-125b的过量表达后子宫内膜癌细胞的增殖能力下降，细胞周期停滞于G1期，细胞凋亡增加[11]。上述结果说明miRNA-125b的作用具有组织特异性，本研究旨在观察miRNA-125b对肺癌细胞A549的增殖及侵袭能力的影响，并探讨其机制。

本研究通过miRNA-125b模拟物转染的方式构建miRNA-125b的高表达模型，经过转染后，A549细胞的miRNA-125b表达水平明显上调，细胞的增殖能力及侵袭能力增加。miRNA-125b调节细胞生物活性的机制较为复杂，既往研究发现BMF是miRNA-125b的潜在靶基因。BMF属于Bcl-2家族，是常见的肿瘤促凋亡蛋白之一，人体BMF记忆位于15号染色体q14，在多种组织(肾脏、胰腺及造血系统等)中广泛表达[12]。在正常细胞中，BMF与动力蛋白复合物结合，处于静止状态；BMF与动力蛋白复合物解离后参与线粒体途径的细胞凋亡，BMF表达水平的下降或表达缺失导致细胞凋亡途径受阻，细胞的增殖能力增加[13-14]。

既往研究发现，miRNA主要通过两种机制调节靶向基因的表达：(1)miRNA与靶基因完全互补结合，切割靶基因的mRNA从而抑制其表达；(2)当miRNA与靶基因不完全互补时，miNAR主要抑制靶基因的翻译过程，而不影响mRNA的稳定性[15]。部分miRNA可以通过上述两种机制抑制靶基因的表达，而miRNA-125b对靶基因BMF的作用机制有待于进一步研究。

综上所述，miRNA-125b能通过抑制BMF的表达促进肺癌细胞A549的增殖及侵袭。

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