高效液相色谱-串联质谱检测苹果醋中非法添加物西布曲明及其去甲基衍生物

王百川，傅泽田，张小栓，孔维府，徐榕雪，宫祥博

(1.中国农业大学 烟台研究院，山东 烟台 264000；2.中国农业大学 工学院，北京 100068)

苹果醋，是指以苹果汁发酵而成的苹果原醋，再兑以苹果汁等原料而成的饮品。苹果醋含有维他命、矿物质及酵素，其酸性成分能疏通软化血管、杀灭病菌、增强人体的免疫力和抗病毒能力、改善消化系统等。由于苹果醋有美容养颜、减肥的功效，所以近几年来广受大众的喜爱。但一些不法商贩在苹果醋中加入西布曲明及其去甲基衍生物等化学药品提高其减肥效果。若消费者在不知情的情况下，大量饮用含有西布曲明及其衍生物的苹果醋，会引起血压升高、心率加快、厌食、失眠、肝功能异常等严重后果。目前，对西布曲明及其衍生物的检测报道较少，杨春华等[1]采用甲基化将西布曲明衍生至其代谢物的方法测定了西布曲明及其代谢物的总量；陈稚等[2]采用HPLC-ESI-MS单级质谱法测定保健品中N，N-双去甲基西布曲明。目前，针对苹果醋中西布曲明及其去甲基衍生物的检测尚未见报道。本试验建立了液相色谱-三重四级杆质谱法检测苹果醋中西布曲明及其去甲基衍生物，在国内尚属首次。

1 材料与方法

1.1 试验试剂

乙腈：色谱纯，Fisher Chemical 提供，批号：75-05-8；甲醇：色谱纯，Dikma 提供，批号：67-56-1； 乙酸：色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司提供，批号：20140421；乙酸铵：优级纯，天津市光复科技发展有限公司提供，批号：50166。

1.2 标准物质

西布曲明：中国食品药品检定研究院提供，批号：100624-200401，纯度：99%；N,N-双去甲基西布曲明：中国食品药品检定研究院提供，批号：520002-201301，纯度：98.5%；

N-单去甲基西布曲明：中国食品药品检定研究院提供，批号：520001-201301，纯度：99%。

1.3 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC○RBEH C18柱(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；流动相：A：乙腈，B：含0.1%乙酸的10 mmol/L乙酸铵；流速：0.2 mL/min；进样体积：10 μL。梯度洗脱见表1。

表1 梯度洗脱Table 1 Gradient elution

1.4 质谱条件

DGU20A-API3200 质谱仪：质谱参数：ESI正离子模式。离子源参数见表2。

表2 离子源参数Table 2 Ion source parameters

扫描模式：多反应检测(MRM)。多反应检测模式见表3。

表3 多反应检测模式Table 3 MRM mode

1.5 标准曲线的配制

1.5.1 标准储备液的制备

精密称取10 mg西布曲明、N-单去甲基西布曲明、N，N-双去甲基西布曲明至10 mL容量瓶中，用60%甲醇溶液定容至刻度，摇匀。

1.5.2 标准混合中间溶液的制备

分别吸取0.4 mL的储备液至10 mL容量瓶中，用60%甲醇溶液定容至刻度，摇匀。

1.5.3 标准混合工作溶液的配制

精密称取空白样品0.3 g于10 mL容量瓶中，精密加入10，20，40，60，80，120 μL标准混合中间溶液，用60%甲醇溶液定容至10 mL，涡旋60 s后超声提取60 min(功率：700 W)，期间每隔5 min漩涡震荡30 s，冷却至室温后4500 r/min离心10 min。取上清溶液50 μL，加甲醇稀释至1 mL，涡旋30 s，过0.22 μm有机滤膜即得西布曲明、N,N-双去甲基西布曲明和N-单去甲基西布曲明浓度范围为2，4，8，12，16，24 ng/mL的基质标准曲线。

1.6 样品制备

精密称取空白样品0.3 g于10 mL容量瓶中，用60%甲醇溶液定容至10 mL，涡旋60 s后超声提取60 min(功率：700 W)，期间每隔5 min漩涡震荡30 s，冷却至室温，4500 r/min 离心10 min，取2.5 mL溶液用甲醇定容至50 mL，摇匀，上清液过0.22 μm膜，备用。

1.7 检出限与定量限

精密称取空白样品0.3 g于10 mL容量瓶中，加适量混合标准工作溶液，用60%甲醇溶液定容至10 mL，涡旋60 s后超声提取60 min(功率：700 W)，期间每隔5 min漩涡震荡30 s，冷却至室温，4500 r/min离心10 min，取2.5 mL溶液用甲醇定容至50 mL，摇匀。用空白样品溶液将此溶液稀释至产生3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比(S/N)。根据色谱图测得信噪比，按S/N=3∶1，S/N=10∶1，计算检出限和定量限。

1.8 方法的准确性

低浓度加标回收溶液：称取0.3 g空白样品于10 mL容量瓶中，加入适量标准混合工作溶液，按样品制备方法操作，配制成4 ng/mL的质控样品。

中浓度加标回收溶液：称取0.3 g空白样品于10 mL容量瓶中，加入适量标准混合工作溶液，按样品制备方法操作，配制成8 ng/mL的质控样品。

高浓度加标回收溶液：称取0.3 g空白样品于10 mL容量瓶中，加入适量标准混合工作溶液，按样品制备方法操作，配制成16 ng/mL的质控样品。

1.9 精密度

称取3份0.3 g空白样品于3个10 mL容量瓶中，每瓶分别加入标准混合工作溶液10，20，40 μL，按样品制备方法操作得供试品溶液，供试品溶液连续进样6针，计算试样中西布曲明、N,N-双去甲基西布曲明和N-单去甲基西布曲明含量及其RSD值，得精密度结果。

1.10 重复性

取浓度为2，4，8 ng/mL的质控(QC)样品各6份，经前处理后进样分析，测得3种非法添加物的峰面积代入随行的基质标准曲线，计算浓度及其RSD，得重复性结果。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

精密称取空白样品0.3 g于10 mL容量瓶中，精密加入10，20，40，60，80，120 μL标准混合中间溶液，按上述方法进行前处理，即得西布曲明、N,N-双去甲基西布曲明和N-单去甲基西布曲明浓度范围为2，4，8，12，16，24 ng/mL的基质标准曲线。将10 mL混标注入LC-MS/MS中，测定相应的峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线并列出标准曲线的线性方程和线性范围。

图1 西布曲明的标准曲线Fig.1 Standard curve of sibutramine

图2 N-单去甲基西布曲明的标准曲线Fig.2 Standard curve of N-desmethyl sibutramine

图3 N,N-双去甲基西布曲明的标准曲线Fig.3 Standard curve of N,N-di-desmethyl sibutramine

由图1～图3可知，西布曲明及其去甲基衍生物在浓度2～24 ng/mL的浓度范围内r值依次为0.9994，0.9998，0.9999，均大于0.99，表明西布曲明及其去甲基衍生物在上述线性范围良好，选取2～24 ng/mL为本试验的线性范围。

2.2 专属性、检出限和定量限

目标化合物出峰处无干扰，一级质谱图、二级质谱图应清晰可见。

采用空白样品加标的方法测定[3-7]，精密称取空白样品0.3 g于10 mL容量瓶中，按上述方法进行前处理，得空白样品溶液。用空白样品溶液将混标标准工作液稀释至产生3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比(S/N)。

西布曲明的方法检出限为15.8 μg/kg，定量限为49.5 μg/kg。N,N-双去甲基西布曲明的方法检出限为58.6 μg/kg，定量限为195.4 μg/kg。N-单去甲基西布曲明的方法检出限为18.0 μg/kg，定量限为61.2 μg/kg。

图4 西布曲明、N-单去甲基西布曲明、N，N-双去甲基西布曲明一级质谱图Fig.4 MS spectra of sibutramine, N-desmethyl sibutramine,N,N-di-desmethyl sibutramine

图5 N，N-双去甲基西布曲明二级质谱图Fig.5 MS2 spectra of N,N-di-desmethyl sibutramine

图6 西布曲明二级质谱图Fig.6 MS2 spectra of sibutramine

图7 N-单去甲基西布曲明二级质谱图Fig.7 MS2 spectra of N-desmethyl sibutramine

由图5～图7可知，西布曲明、N-单去甲基西布曲明、N，N-双去甲基西布曲明二级质谱图结果一致，可能的原因是邻近N原子的C-C键容易发生α断裂，N原子所在的基团形成中性丢失，这与沈国芳、朱建所得结论一致。

2.3 方法的准确性

采用空白样品加标回收法测定，取浓度分别为4，8，16 ng/mL的质控(QC)样品3份经前处理进样分析，每种浓度平行进样3针，测得3种非法添加物的峰面积代入随行的基质标准曲线，计算浓度，除以理论加入浓度，得方法回收率，即准确度结果。

表4 不同浓度下的西布曲明回收率结果(n=3)Table 4 Recoveries of sibutramine at different concentration levels(n=3)

表5 不同浓度下 N，N-双去甲基西布曲明回收率结果(n=3)Table 5 Recoveries of N,N-di-desmethyl sibutramine at different concentration levels(n=3)

表6 不同浓度下N-单去甲基西布曲明回收率结果(n=3)Table 6 Recoveries of N-desmethyl sibutramine at different concentration levels(n=3)

由表4～表6可知，西布曲明、N-单去甲基西布曲明、N，N-双去甲基西布曲明在高、中、低3个水平回收率均在80%～110%之间。低浓度回收率略低，随着浓度的增大，回收率接近100%，这是因为在低水平时，系统误差较大，随着浓度的增加，系统误差逐渐变小。

2.4 方法的重复性

表7 重复性测定结果(西布曲明) Table 7 Repeatability(RSD)of sibutramine

表8 重复性测定结果(N-单去甲基西布曲明)Table 8 Repeatability(RSD)of N-desmethyl sibutramine

表9 重复性测定结果(N,N-双去甲基西布曲明)Table 9 Repeatability(RSD)of N,N-di-desmethyl sibutramine

取浓度为4 ng/mL的质控(QC)样品各6份经前处理后进样分析，测得3种非法添加物的峰面积代入随行的基质标准曲线，计算浓度及其RSD，获得重复性结果。由表7～表9可知重复性RSD小于5%，表明方法重复性良好。

2.5 方法的精密度

表10 精密度测定结果(西布曲明)Table 10 Precision(RSD)of sibutramine

表11 精密度测定结果(N-单去甲基西布曲明)Table 11 Precision(RSD)of N-desmethyl sibutramine

表12 精密度测定结果(N,N-双去甲基西布曲明)Table 12 Precision(RSD)of N,N-di-desmethyl sibutramine

取浓度为4 ng/mL的质控(QC)样品1份连续测定6次。测得3种非法添加物的峰面积代入随行的基质标准曲线，计算浓度。由表10～表12可知，西布曲明、N-单去甲基西布曲明、N，N-双去甲基西布曲明精密度均小于3%，表明仪器精密度良好。

3 结论

本试验针对苹果醋中西布曲明及其去甲基衍生物建立了液相色谱-串联质谱检测方法。着重考察了该方法的检出限、定量限、专属性、线性范围、方法的准确性、重复性、精密度等指标。结果显示：该方法在2～24 ng/mL范围内具有良好的线性；方法检出限为西布曲明15.8 μg/kg、N,N-双去甲基西布曲明58.6 μg/kg、N-单去甲基西布曲明18.0 μg/kg；添加浓度在4，8，16 ng/mL 3个水平条件下的平均回收率在85%～100%之间；3种化合物重复性小于5%，精密度小于3%。该方法具有操作简单、干扰少、灵敏度高、稳定性好、结果准确等特点，适用于苹果醋中西布曲明及其去甲基衍生物的测定。

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