不同刺激环境对小鼠诺如病毒在RAW264.7细胞中复制的影响

刘捷

（解放军南京总医院比较医学科，南京 210002）

0 引言

小鼠诺如病毒（murine norovirus，MNV）可以在传代细胞小鼠巨噬细胞系RAW264.7内生长并产生细胞病变效应（cytopathic effects，CPE）[1]，因为小鼠诺如病毒是目前为止发现的仅有的能在体外进行有效增殖的病毒株，因此可作为体外研究诺如病毒的理想材料，诺如病毒具有很强的抗原性，感染后发病主要表现为急性肠胃炎，现无可应对其感染的疫苗[2]。通过研究不同刺激环境对小鼠诺如病毒在RAW264.7细胞中复制的影响，可有助于运用传代细胞小鼠巨噬细胞系RAW264.7进行小鼠诺如病毒的培养、增殖和分离[3]。对于除小鼠诺如病毒外其他种类诺如病毒的研究、检测及疫苗研发工作有积极作用。试验通过比较不同培养条件下，使用RAW264.7细胞培养病毒的效果，探索培养液酸碱度，胰酶含量对小鼠诺如病毒在RAW264.7细胞中复制的影响。

1 材料与设备

1.1 试验材料与试剂

试验中使用的病毒株为本实验室分离鉴定所得的小鼠诺如病毒；传代细胞小鼠巨噬细胞系RAW264.7购自上海纪宁；培养基（DMEM）和胎牛血清购自维森特生物技术（南京）有限公司；Hank's生物缓冲液由北京索莱宝科技有限公司生产；胰蛋白酶由武汉千润生物工程有限公司生产。

1.2 试验仪器与设备

试验仪器与设备有培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯等，见表1。

表1 试验仪器

仪器名称 型号 产地超净工作台 SW-CJ-IBU 苏州净化设备有限公司荧光显微镜 Olympus BX51 日本电热恒温培养箱 HNY-2112B 天津市欧诺仪器仪表有限公司

2 试验方法

2.1 小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞的培养

试验用具消毒：超净台用酒精擦净紫外照射20 min左右，试验前将培养液及药品加温到37 ℃，所有操作尽量靠近酒精灯火焰，防止细胞间交叉污染。

当细胞贴壁生长到瓶底70%时，弃去培养液，加PBS 10 mL漂洗1～2次，将漂洗液弃去。加入5 mL PBS，将细胞刮下后用移液枪反复吹打溶液，将有细胞的培养液分入新的培养瓶，放置到37 ℃、5% 的CO2孵箱中，几小时后细胞即可再次贴壁生长。另外，定时观察细胞生长情况，及时进行传代操作[4]。

2.2 细胞试验设计

2.2.1 不同酸碱度培养液对小鼠诺如病毒在RAW264.7细胞上适应的影响

病毒的稳定pH范围为6.0～8.0，当培养液的pH小于4.0或者大于9.0时，病毒的感染能力会被过酸或过碱的环境破坏，同时细胞的生长形态改变受其影响较小，因此在设计试验的pH范围时，先将配置好的培养液在培养箱里放至少15 min，使溶液的二氧化碳达到饱和，当培养液温度到37 ℃后，测量其pH。通过添加酸或碱，配置pH浓度梯度为6.0、6.5、7.5、8.0的DMEM培养液，接入已感染MNV的小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞，同时设置不变条件对照组。

2.2.2 不同胰酶浓度对小鼠诺如病毒在RAW264.7细胞上适应的影响

设计试验的胰蛋白酶培养基中范围为5、6、7 μg/mL，接入已感染MNV的小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞，同时设置一组不加胰酶的对照组。

2.3 病毒接种和细胞病变形态观察

小鼠诺如病毒在感染宿主细胞后细胞病变表现为细胞边缘不整齐，部分核固缩，细胞死亡等[5]。培养18 h后观察细胞病变情况。

2.4 免疫荧光试验

将培养一段时间后的试验组和对照组细胞孔中的营养液弃去，用PBS洗涤3次，室温干燥后，预冷80%丙酮（4 ℃）固定10 min。PBS洗涤后充分干燥备用。加入兔抗MNV VP1多克隆抗体（实验室制备），37 ℃孵育1 h，PBS洗涤后，加入Alexa Fluor 555标记的荧光二抗（碧云天生物技术公司），37 ℃孵育1 h，PBS洗涤后备用，在荧光显微镜下观察。

2.5 数据分析

每个样品进行3次平行试验，纪录试验数据并制作数据表格。

3 结果与讨论

3.1 细胞病变形态观察

定时抽取接种了小鼠诺如病毒培养液中的细胞进行观察，在显微镜下观测到细胞形态发生了改变，正常形态下RAW264.7细胞为圆形、贴壁生长、生长速度较快、细胞难消化，在被病毒感染后，在显微镜下观察到细胞边缘不整齐，部分核固缩，细胞死亡。

3.2 酸碱度对病毒在细胞中复制的影响

小鼠诺如病毒在培养液pH在7.5左右时，在巨噬细胞系RAW264.7中的复制最活跃，在培养液pH为6.0～6.5时，病毒的复制最不活跃，见表2。

表2 不同pH下MNV感染RAW264.7情况

3.3 胰酶添加量对病毒在细胞中复制影响

小鼠诺如病毒在培养液胰酶添加量为6～7 μg/mL时，在巨噬细胞系RAW264.7中的复制最活跃，见表3。

表3 不同胰酶添加量下MNV感染RAW264.7情况

4 结论

当使用小鼠诺如病毒感染细胞后，由于病毒具有抗原的性质，使感染后的巨噬细胞系RAW264.7在遇到相应的抗体时发生抗原抗体特异性反应，在固定于培养孔上会形成抗原抗体复合物。由于加入的第二抗体荧光素结合物仍然能与发生了抗原抗体特异性反应的复合物结合，将会再次发生抗体抗原反应，最后通过荧光发光。因此，可以通过观察在荧光显微镜下荧光的有无和强弱，进而判断病毒在细胞中的复制情况。

试验表明，体外培养小鼠诺如病毒感染RAW264.7细胞时，当控制其他变量恒定时，随着培养液pH的改变，小鼠诺如病毒的复制在酸性条件下不变，在碱性条件下病毒复制速率加快。随着胰酶添加量的增加，对小鼠诺如病毒的复制速率增加。通过对以上试验结果进行分析，小鼠诺如病毒在小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞中最佳培养条件是放置37 ℃、5% CO2培养箱中培养。其中当DMEM培养液的pH为7.5左右或者胰酶的含量在6～7 μg/mL时，小鼠诺如病毒的复制速率加快。为便于观测和试验的准确性，含有小鼠诺如病毒的细胞传代次数应控制在4代以内。