重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白抗体中和活性检测方法的建立

崔颖，李晓然，刘福星，朱振宇

北京泰德制药股份有限公司 研发中心，北京 100176

注射用重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白（recombinant human thrombopoietin mimet⁃ic peptide-Fc fusion protein，TMP-Fc）是罗米司亭（romiplostim）的生物类似药，主要用于治疗慢性特发性血小板减少性紫癜（idiopathic thrombocyto⁃penic purpura，ITP）。

目前ITP的治疗包括以免疫抑制药物和脾切除为主的传统治疗方式和以增加血小板生成为机理的促血小板生成素（thrombopoietin，TPO）受体激动剂治疗法。第一代TPO受体激动剂以TPO重组蛋白或其同源序列蛋白为主，会引发机体产生内源性TPO的中和抗体，使内源性TPO水平降低，导致血小板水平低于用药前，因此在欧美等国未被批准上市[1-2]。

TMP-Fc和罗米司亭属于第二代TPO受体激动剂，在人抗体IgG1的Fc片段C端连接2段TPO模拟肽。其中抗体Fc段可与新生Fc受体（FcRn）结合，避免进入溶酶体中被降解，延长药物在体内的半衰期，降低用药频率；TPO模拟肽段发挥作用的原理与TPO一致，通过与巨核细胞表面的TPO受体Mpl（由myeloproliferative leukemia virus即骨髓增殖白血病病毒基因表达）结合，进而激活JAK-STAT等信号通路，促进巨核细胞发育并产生血小板，从而达到升高血小板的作用[3]。

TMP-Fc作为重组蛋白注入机体，通常会引发机体产生针对药物本身甚至针对内源性蛋白的抗体[4]。由于TPO模拟肽是采用噬菌体展示技术筛选出的与TPO作用一致、无序列同源性的短肽，因此药物在体内不会产生针对内源性TPO的中和抗体，药物安全性较高。但是机体仍然会产生针对药物本身的抗体，如果该抗体只是与药物结合并不影响药物的生物学活性，称之为结合抗体；如果该抗体与药物发挥作用的活性区域或活性区域附近位点结合，影响药物的体内生物学活性，称之为中和抗体。中和抗体的产生会影响药物的有效性，因此在生物制品开发过程中对中和抗体的监测十分重要。为评价TMP-Fc在免疫原性研究中产生抗体的性质，我们开发了基于MO7e细胞增殖法的TMP-Fc抗体中和活性检测方法，并应用于免疫原性研究中样品的分析。

1 材料和方法

1.1 材料

人巨核细胞白血病细胞株MO7e由天津协和血液研究所提供；罗米司亭由协和麒麟株式会社提供；TMP-Fc活性对照品（批号20131220）由北京泰德制药股份有限公司（以下简称本公司）制备；抗TMP-Fc阳性血清及小鼠抗TMP-Fc单克隆抗体由京天成生物技术（北京）有限公司制备；注射用TMP-Fc重复皮下注射给予食蟹猴的免疫原性血清由北京昭衍新药研究中心股份有限公司提供；RPMI-1640培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素/链霉素双抗溶液、台盼蓝购自Gibco公司；CCK-8购自同仁化学公司；酶标仪和Gene5分析软件为BioTek公司产品。

1.2 MO7e细胞的培养

MO7e细胞为半贴壁细胞，依赖生长因子增殖，可用于测定多种细胞因子的活性[5]。该细胞培养时若不加入细胞因子，生长异常缓慢甚至死亡，因此常规培养基为RPMI-1640培养基＋10%FBS+粒细胞集落刺激因子（GM-CSF）。传代按活细胞浓度 5×104～10×104/mL的密度接种，于 37℃、5%CO2培养箱中常规培养，3～4 d传代1次，待细胞长至对数生长期可用于检测。

1.3 TMP-Fc促进MO7e细胞增殖的方法确立

根据本公司自主开发的TMP-Fc生物学活性检测方法，TMP-Fc活性对照品起始浓度为50 μg/mL，1/5梯度稀释至0.0256 ng/mL，共9个梯度浓度，按50 μL/孔加入96孔板中；取对数生长期的MO7e细胞，用无血清RPMI-1640培养基洗2～3次，将常规培养中的GM-CSF去除，调整细胞密度至 2×105/mL，按 150 μL/孔接种于 96 孔板中，于37℃、5%CO2培养箱中培养60～72 h；加入CCK-8溶液 10 μL，37℃、5%CO2培养箱中继续培养 2 h，于酶标仪上测定D450nm和D600nm值，利用Gene5软件制作四参数回归曲线，确定TMP-Fc促进MO7e细胞增殖的范围。

1.4 抗TMP-Fc阳性血清对MO7e细胞增殖的影响

以TMP-Fc促进Mo7e细胞增殖法为基础，选择处于对数增长期的3个TMP-Fc浓度（80、16和3.2 ng/mL），分别与梯度稀释的阳性血清（过滤除菌）等体积混匀，50 μL/孔加入96孔板中。按照1.3的方法处理细胞，接种培养并显色分析。

1.5 空白血清对MO7e细胞增殖的影响

将混合空白猴血清（PMS）进行梯度稀释（1/5、1/10、1/20、1/40）制备成不同浓度的样本；将一定浓度的TMP-Fc作为药物对照，按50 μL/孔加入96孔板中；按照1.3的方法处理细胞，接种培养并显色，于酶标仪上测定D450nm和D600nm值，根据样本吸光度值计算样本抑制率，以确定不影响检测的样本最小稀释率。

1.6 TMP-Fc抗体中和活性检测方法的药物浓度筛选

将1/10稀释的PMS与一定浓度的TMP-Fc溶液等体积混合，作为单抗稀释液，将抗TMP-Fc单克隆抗 体系 列稀释 至 20、60、180、540、1620、3200 ng/mL，按 50 μL/孔加入 96孔板，按照 1.3的方法处理细胞，接种培养并显色分析。

1.7 TMP-Fc抗体中和活性检测方法实验阈值确定

将25个空白食蟹猴血清分别用MO7e细胞培养液稀释至1/10，过滤后与32 ng/mL的TMP-Fc等体积混合，作为实验阈值（cut point，CP）样本，此样本的TMP-Fc浓度为16 ng/mL，血清稀释率为 1/20；将稀释至 1/10的 PMS与 32 ng/mL的TMP-Fc溶液等体积混合，作为阴性对照。采用MO7e细胞增殖法检测CP样本对细胞增殖的抑制率。独立重复3次，每个样本设置复孔，根据样本及阴性对照吸光度（D）值计算抑制率。

计算每一次独立实验CP样本的抑制率均值和标准差；在99.9%的置信水平下，单次实验阈值=均值+3.09×标准差；3批次实验阈值的平均值即为筛选实验阈值[6]。

1.8 食蟹猴免疫原性血清样本的检测

根据TMP-Fc重复皮下注射给予食蟹猴4周和恢复期4周的免疫原性的结合抗体检测结果，将结合抗体检测为阳性的血清进行中和抗体检测。将待检血清稀释至1/10，与32 ng/mL的TMP-Fc等体积混合，作为待检样本，按50 μL/孔加入96孔板中，按照1.3的方法处理细胞，接种培养并显色，于酶标仪上测定D450nm和D600nm值，根据样本吸光度值计算样本抑制率，根据实验阈值判定样本中和抗体是否为阳性。

2 结果

2.1 TMP-Fc促进MO7e细胞增殖的方法确立

基于TMP-Fc与MO7e细胞表面TPO受体（Mpl）结合进而引起细胞增殖的原理，将梯度稀释的TMP-Fc与MO7e细胞相互作用，通过比色法测定细胞增殖情况，建立测定TMP-Fc活性的MO7e细胞增殖法。

TMP-Fc对MO7e细胞增殖具有促进作用，细胞增殖曲线如图1，随着TMP-Fc浓度的增加，呈典型“S”型增殖曲线。3次实验细胞增殖曲线重复性较好，说明方法稳定可靠，细胞增殖曲线对数增长期对应的浓度范围均为3.2～80 ng/mL，为后续抗体中和活性检测方法的建立奠定了基础。

2.2 抗TMP-Fc阳性血清对MO7e细胞增殖的影响

抗体中和活性检测方法的原理是基于中和抗体能减弱甚至消除药物的生物学活性。文献建议选择一定的药物浓度，在此浓度下检测中和抗体对药物作用的影响[7]。选择处于对数增长期3个TMP-Fc浓度（80、16和3.2 ng/mL），分别与梯度稀释的阳性血清等体积混合，以3.2 ng/mL TMP-Fc作为阴性对照，结果如图2所示，在阳性血清稀释率低于1/10 000时，均对MO7e细胞的增殖有明显的抑制作用。TMP-Fc浓度为3.2 ng/mL时细胞增殖作用不明显，因此选择16～80 ng/mL建立抗体中和活性检测方法。

2.3 空白血清对TMP-Fc促MO7e细胞增殖的影响

抗体中和活性检测方法为MO7e细胞增殖法，通常动物血清会干扰细胞的生长状态，进而影响检测结果。根据文献报道及FDA建议[8]，最小稀释率一般不超过1/100，否则会影响方法的灵敏度。

表1结果显示，含PMS浓度5%（1/20稀释）以上时，会对TMP-Fc促细胞增殖产生明显的抑制作用（抑制率达31.30%～55.39%），对中和抗体的检测产生影响；含PMS浓度5%（1/20稀释）以下时，对TMP-Fc促细胞增殖的抑制作用相对较弱，对中和抗体的检测影响较小。血清浓度5%（1/20稀释）与血清浓度2.5%（1/40稀释）对细胞增殖的抑制率分别为16.59%和12.50%，说明进一步稀释血清并未明显降低基质干扰作用，因此选择血清的最小稀释率为1/20，在干扰较小的情况下尽量提高方法的灵敏度。

表1 空白血清对TMP-Fc促MO7e细胞增殖的影响

图1 TMP-Fc促进MO7e细胞增殖反应曲线

图2 抗TMP-Fc血清对MO7e细胞增殖的抑制作用

2.4 TMP-Fc抗体中和活性检测方法的药物浓度筛选

根据2.2及2.3的结果，将抗TMP-Fc单克隆抗体梯度稀释，保证血清最小稀释率为1/20，TMP-Fc终浓度分别为16和80 ng/mL，考察不同药物浓度下方法的灵敏度。结果见图3，在同样单抗浓度下，TMP-Fc浓度为16 ng/mL时较80 ng/mL对细胞增殖的抑制效果更为明显，因此后续实验选择用16 ng/mL（与样本等体积混合后的浓度）作为检测TMP-Fc抗体中和活性的药物浓度。

2.5 TMP-Fc抗体中和活性检测方法实验阈值确定

根据FDA建议[8]，实验阈值的确定至少需要对5～10个阴性对照样本的检测结果进行统计分析。本法采用25个空白猴血清确定CP。TMP-Fc抗体中和活性检测方法的CP确定共进行3次独立实验，结果见表2，CP平均值为23.78%。TMPFc中和抗体检测的CP确定为23.78%，即抑制率≥23.78%检测结果判定为阳性，反之则为阴性。

2.6 食蟹猴免疫原性血清样本的检测

根据确立的TMP-Fc抗体中和活性检测方法，将注射用TMP-Fc与原研药罗米司亭给予食蟹猴4周恢复期4周免疫原性样本中结合抗体检测为阳性的样本进行中和抗体检测，结果见表3，中和抗体阳性率检测统计结果见表4。

注射用TMP-Fc与罗米司亭在300 μg/kg剂量下，TMP-Fc中和抗体个体发生率为30%（3/10），略低于罗米司亭的40%（4/10），表明二者在免疫原性方面相似。

3 讨论

人用生物技术药物在动物体内有免疫原性，根据《ICH药品注册国际要求》和我国《新生物制品审批办法》的要求，在进行重复给药的毒理性研究中，应评价受试动物体内产生的抗体性质，并与毒理/药理变化联系起来[9]。

图3 TMP-Fc抗体中和活性检测方法药物浓度筛选

表3 食蟹猴免疫原性血清样本中和抗体检测结果（抑制率）

表4 注射用TMP-Fc组与原研药罗米司亭中和抗体阳性率

MO7e细胞表面特异性天然表达Mpl，在一定浓度范围内，TMP-Fc可刺激MO7e细胞增殖。我们首先研究了TMP-Fc促进MO7e细胞增殖的浓度范围，以及抗TMP-Fc阳性血清对MO7e细胞增殖的影响；在此基础上确定血清最佳稀释率，最佳药物浓度及实验阈值，建立TMP-Fc抗体中和活性检测方法，并应用于免疫原性样本分析，为评价临床前安全性提供依据。

在长期毒性实验中，TMP-Fc与罗米司亭在300 μg/kg剂量下，TMP-Fc中和抗体个体发生率略低于罗米司亭，表明在免疫原性方面TMP-Fc与罗米司亭相似。

目前治疗用重组生物制品的体外生物学活性测定推荐使用细胞法，因细胞法能反映药物的作用机制。中和抗体检测方法是基于中和抗体抑制药物本身的生物学活性而建立的，本研究以MO7e细胞增殖法检测TMP-Fc生物学活性为基础，建立药物中和抗体检测方法，有效反映药物及中和抗体的作用机制。虽然细胞法较非细胞法（如配体结合法）变异系数较大、对基质效应更敏感、试验过程中干扰因素多，但是更能反映体内作用机制，是目前FDA、CFDA等监管机构更推荐的研究方法。因此，开发一种灵敏的、稳定的基于细胞法的中和抗体检测方法，对于科学评价大分子药物在临床前、临床试验期间的安全性、有效性具有重要意义。

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