利用SSR标记分析蚕豆品种（品系）与优异种质的遗传多样性

张红岩 郭兴莲 杨 涛 刘 荣 黄宇宁 季一山 王 栋宗绪晓*

（1中国农业科学院作物科学研究所，北京100081；2青海大学新农村发展研究院，青海西宁 810016；3青海省海东市互助县农业技术推广中心，青海海东 810500）

蚕豆（Vicia fabaL.）为豆科蝶形花亚科巢菜属的唯一栽培种，为越年生（秋播）或一年生（春播）草本植物（郑卓杰，1997）。据FAO统计，2005～2014年全世界干蚕豆平均生产面积为243.25万hm2，总产量429.80万t，其中中国生产面积为96.99万hm2，总产量164.877万t，分别占世界的35.76%和38.36%（FAO，2017）。蚕豆在我国已有2 000余年的栽培历史，是一种重要的粮食、蔬菜和饲料、绿肥兼用作物（马钰，2012），是豆类蔬菜中重要的食用豆之一。

种质资源的多样性是育种工作的基础。早期，人们主要采用形态学的方法对蚕豆的遗传多样性进行研究（Robertson & El-Sherbeeny，1991；Polignano et al.，1999），该方法简便、经济，但鉴定周期较长、易受环境影响（王伟 等，2009）。随着分子生物技术的快速发展，RAPD（Link et al.，1995）、AFLP（Zeid et al.，2004）、ISSR（Fernandez et al.，2002；Terzopoulos & Bebeli，2008）等分子标记技术被应用于蚕豆种质资源的遗传多样性研究之中。Link等（1995）利用RAPD标记对3个蚕豆自交系群体进行研究，结果表明，地中海种和欧洲小粒种被分为截然不同的2组，欧洲大粒种介于两者之间。Zong等（2009）利用10对AFLP引物对204份国内冬性蚕豆资源和39份国外冬性资源进行遗传多样性分析，聚类分析和主成分分析结果表明，中国蚕豆资源与国外蚕豆资源界限明显。王海飞等（2011）利用11对ISSR标记对国内外蚕豆资源的遗传多样性进行分析，揭示了中国春播型蚕豆资源遗传多样性较为丰富，美洲蚕豆种质资源遗传基础相对狭窄。Gong等（2011）利用11对EST-SSR标记对29份国内外蚕豆品种进行遗传多样性分析，发现参试中国蚕豆品种遗传背景较为狭窄。目前，我国蚕豆种质资源的研究水平较为落后，其庞大的基因组严重限制了从分子水平研究蚕豆资源遗传多样性的步伐。

基于全自动遗传分析仪的SSR荧光标记具有省时、高通量、高准确度等特点，目前已应用于农作物的遗传多样性分析。雍洪军等（2009）基于该项技术对我国7个省的90份糯玉米进行遗传多样性分析，初步将供试玉米品种划分为3个类群。王瑞云等（2017）利用15对特异性SSR荧光标记扫描我国11个省的132份糜子资源，聚类分析可将参试糜子资源划分成4类。

蚕豆染色体组2n=12，基因组片段大小约为13 000 kb，基因组庞大、基因组学研究滞后、开发的SSR标记十分有限。本试验利用中国农业科学院作物科学研究所冷季食用豆类课题组自主开发的99对SSR荧光标记引物，对102份国内育成蚕豆品种（品系）及优异种质资源的遗传多样性进行系统研究，旨在揭示中国代表性蚕豆品种（品系）和种质资源间的遗传多样性差异，为我国蚕豆育种产业的快速推进、科学合理选配亲本及挖掘和利用优异资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试蚕豆材料共计102份，其中青海育成品种（品系）27个、云南育成品种19个、江苏育成品种6个、优异种质资源50份。优异种质资源主要是指综合农艺性状优良、具有抗病虫性及抗逆性等特殊性状的蚕豆资源。参试材料均取自国家种质资源中期库，由中国农业科学院作物科学研究所提供，2016年11月种植于中国农业科学院作物科学研究所网室内。参试材料具体信息见表1。

1.2 SSR荧光标记

利用中国农业科学院作物科学研究所冷季食用豆类课题组构建的蚕豆SSR遗传连锁图谱，经8%非变性凝胶电泳多次筛选，获得在连锁群上均匀分布、多态性较高、PCR扩增较稳定的99对SSR标记，标记的5′端分别用FAM（蓝色）、HEX（绿色）荧光染料标记。SSR引物合成及PCR扩增产物荧光检测均委托北京梓熙生物科技有限公司。2×TaqPCR Master Mix购自北京康润诚业生物科技有限责任公司。DNA Marker购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司。

1.3 DNA提取

每份参试材料选择生长良好的4个单株，取幼嫩叶片混合后，采用改良的CTAB法（Wang et al.，2015）提取DNA，提取缓冲液中加入一定量的水溶性PVP和β-羟基乙醇（Gentile et al.，2017；Sokol et al.，2017），可以有效防止酚类物质的氧化作用。采用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，采用NanoDrop 2000软件（Yang et al.，2015）检测DNA浓度，根据检测结果将其稀释到工作液浓度（20～30 ng·μL-1）后于-20 ℃冰箱保存备用。

1.4 SSR-PCR扩增及产物荧光检测

采用10 μL的扩增反应体系，其中2×TaqPCR Master Mix 5 μL，2 μmol·L-1的上、下游引物各 1 μL，DNA（30 ng·μL-1）模板 1.5 μL，ddH2O 2.5 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性35 s，55～60 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，共32个循环；72 ℃延伸5 min，10 ℃保温7 min。

将FAM（蓝色）和HEX（绿色）荧光标记的PCR产物用超纯水稀释25倍，分别取等体积的上述2种稀释液混合，吸取1 μL混合液、0.1 μL LIZ500分子量内标和8.9 μL去离子甲酰胺分别加入到DNA分析仪专用深孔板孔中；然后在PCR仪上95 ℃变性5 min，取出后立即置于碎冰上，冷却15 min左右；瞬时离心10 s，在ABI3700 DNA遗传分析仪上进行检测。

1.5 数据处理

采用DNA Collection和Genemapper软件进行原始数据收集和分析，建立相应数值数据库。采用PopGenversion 1.32软件（孙源文 等，2012）计算群体的等位变异数（observed number of alleles，Na）、有效等位变异数（effective number of alleles，Ne）、Shannon信息指数（I）。采用PowerMarker 3.25软件计算标记位点的多态性信息量（polymorphism information content，PIC）， 以 邻 接 法（neighborjoining）计算参试材料间Nei’s遗传距离，进行聚类分析并用FigTree软件（Rambaut，2009）做树状聚类图。标记系数（marker index，MI）按Senior等（1998）的公式MI=Allele×PIC计算，Allele为该引物的等位基因数。采用Structure 2.2软件（Evanno et al.，2005）进行群体遗传结构分析，Burnin Period和after Burnin各为10 000，K值为1～9，每个K值各运行15次。利用GenALEX 6软件（Peakall &Smouse，2006）计算材料间的遗传距离并进行主成分（PCA）分析。

表1 参试蚕豆类型及来源地

2 结果与分析

2.1 遗传多样性分析

102 份国内蚕豆育成品种（品系）及优异种质在99个SSR位点（表2）共检测出937个等位变异，每对引物平均检测出4～19个等位变异，平均为9.46个。99个位点的多态性信息量PIC值变化范围为0.38～0.88，平均为0.63；标记系数MI变化范围为1.74～15.40，平均为6.19；有效等位变异变化范围为1.79～9.22，平均为3.41；Shannon信息指数变化范围为0.79～2.44，平均为1.45。其中，标记SSR12192的等位变异最多（19个），PIC值为0.78，MI值为14.77，有效等位变异为4.98，Shannon信息指数为2.01；SSR13513、SSR10910与EST2045的等位变异均为4个，它们的PIC值、MI值、有效等位变异与Shannon信息指数也相应较低。

表明等位基因数、多态性信息量PIC、MI值、有效等位基因数与Shannon信息指数整体呈现出一致的变化趋势。

表2 99对SSR标记在102份蚕豆材料中的遗传多样性参数

2.2 不同种质间的遗传关系

2.2.1 聚类分析 基于NJ聚类法，102份参试材料在遗传距离为0.324时被分成两大类（图1）。第一大类全部为青海蚕豆品种（品系），表现为春播生态类型。第二大类为云南、江苏育成品种和蚕豆优异种质资源，整体表现为秋播生态类型。来源于青海的品种（品系）与其他供试材料界限较为明显，可能由于育成品种的骨干亲本多以当地优异农家种为主，或者在独特的地理环境下长期自然选择的结果。来源于青海的两份具有抗逆特性的蚕豆资源F83和F100与青海育成品种（品系）并没有聚类在一起，可能是由于引种所致，这两份资源是否为外来资源还需进一步验证。国内外蚕豆优异种质资源与云南和江苏蚕豆品种聚类在一起，这为我国秋播型蚕豆育种研究、科学选配亲本及挖掘和利用优异资源提供了依据。

图1 102份蚕豆材料的NJ聚类图

由表3可以看出，优异蚕豆种质资源和不同省份蚕豆品种的等位变异不同，其中优异蚕豆资源组群最高，其次为青海组群和云南组群，江苏组群最低。有效等位变异最高为优异蚕豆资源，其次为青海组群和云南组群，江苏组群最低。Shannon信息指数变化趋势与有效等位变异相同，优异蚕豆资源＞青海组群＞云南组群＞江苏组群。综合各组群间的遗传多样性参数可知，优异蚕豆资源遗传多样性较高，其次为青海组群和云南组群，江苏组群遗传多样性相对最低。

表3 优异蚕豆种质与不同省份蚕豆品种（品系）间遗传多样性参数

由表4可以看出，优异种质资源与云南品种和青海品种（品系）之间的亲缘关系相对较近，与江苏品种的亲缘关系相对较远，各蚕豆组群之间的亲缘关系从某种程度上反映了优异种质资源在蚕豆主要产区的适应性。青海品种（品系）与江苏品种、云南品种亲缘关系相对较近，云南品种与江苏品种之间亲缘关系相对较远。综合来看，不同地理来源的蚕豆材料具有一定的地域生态性。

表4 优异蚕豆种质与不同省份蚕豆品种（品系）组群的遗传相似系数（右上）与遗传距离（左下）

2.2.2 群体结构分析 采用Structure 2.2软件对102份参试材料进行群体结构分析，因后验概率值〔lnP（D）〕随亚群数的增大而增大，故采用基于ΔK的最大似然估计确定适宜亚群数。结果表明，102份参试材料在K=3时ΔK出现峰值，即参试材料从群体结构上可被分为3个亚群（图2）。进一步研究Structure软件分析得到的亚群和地理生态型间的关系发现，亚群Ⅰ主要包括青海全部品种（品系）和小部分优异种质资源；亚群Ⅱ主要包括云南大部分品种以及小部分优异种质资源；亚群Ⅲ主要包括江苏全部品种、大部分优异种质资源以及小部分云南品种。可见，亚群分类结果与参试材料地理来源及生态类型存在一定程度的相关性。

图2 102份蚕豆材料的群体遗传结构图

2.2.3 主成分分析 主成分分析结果与Structure群体遗传结构分析结果基本一致。102份蚕豆材料呈现出交叉分布的现象，在一定程度上说明其遗传基础较为广泛（图3）。第一大类主要以云南育成品种为主，中间混杂个别优异种质资源；第二大类全部为青海育成品种（品系）；第三大类主要为大部分优异种质资源以及全部江苏育成品种。

图3 102份参试蚕豆材料的PCA分析

3 结论与讨论

3.1 SSR荧光标记技术

SSR荧光标记检测技术利用不同荧光基团染料（例如HEX、ROX、TET、FAM、Texas、Red）标记引物，通过全自动DNA分析测序仪精确分析PCR扩增产物的片段大小。传统的银染法经济，但灵敏度较低、数据的有效整合性较差，同一胶板或不同胶板上样品谱带间相对位置难以有效识别，严重制约了数据的准确性。相对而言，SSR荧光标记检测技术具有高通量、高灵敏度、高准确性、数据一致性高等优点，可实现不同板数样品间数据的有效整合。目前，该项技术已广泛应用于玉米（张全芳 等，2017）、枸杞（尹跃 等，2017）、水稻（王玲等，2015）、甘蓝型油菜（周梦妍 等，2015）、高粱（王瑞 等，2015）等作物。郝晨阳等（2005）利用24对SSR标记扩增小麦基因组，通过银染法检测到235个等位变异，每对引物平均检测到3～20个等位变异，平均为9.8个；基于SSR荧光标记技术检测到312个等位变异，每对引物平均检测到4～24个等位变异，平均为13.0个。通过分析两种SSR分型方法，相对于银染技术，荧光标记检测技术可以检测到更多的等位变异，检测效果更为理想，灵敏度更高，更适于当前作物遗传多样性和指纹图谱构建的分析与研究。

3.2 蚕豆遗传多样性研究进展

早期人们主要通过蚕豆的主要农艺性状（生育期、种皮颜色、株高、籽粒大小、分枝数、有效荚数等）开展遗传多样性研究。康智明等（2015）对6份国内秋播型蚕豆品种和6份国外主栽品种进行农艺性状和品质的遗传多样性分析，结果表明品种的亲缘关系与地理来源关系不大。徐东旭等（2010）通过分析国内外不同地理来源的637份蚕豆种质资源的18个农艺性状，推断出参试资源由三大基因库组成，国内春、冬性蚕豆种质资源间以及国内外资源间具有较大的遗传变异。随着分子标记技术的日益成熟，不同类型的分子标记被应用到蚕豆基础性研究之中。本试验利用99对荧光SSR标记分析102份中国代表性蚕豆品种（品系）和优异种质，聚类分析显示春播型和秋播型蚕豆界限较为明显，这与前人研究结果一致。优异蚕豆资源的遗传多样性明显高于育成品种（品系），优异种质资源与云南品种和青海品种（品系）之间的亲缘关系相对较近，从某种程度说明优异种质整体上可以适应两地生态环境。在今后蚕豆育种过程中，建议育种家们扩大种质资源的筛选，充分挖掘和利用优异种质资源，提高育种效率。

3.3 种质资源创新是蚕豆育种的关键

优异的种质资源是培育优良作物品种的遗传物质基础，调查、收集和保存蚕豆种质资源显得尤为重要。蚕豆作为世界上第六大类食用豆类作物，我国拥有丰富的蚕豆种质资源，同时也是全球蚕豆栽培面积和总产量最高的国家。当前我国蚕豆育种主要目标以产量为主，部分骨干亲本的过度使用造成了蚕豆品种间的遗传基础狭窄。本试验通过对102份蚕豆品种（品系）和优异种质资源进行遗传多样性分析，云南、青海和江苏育成品种界限较为明显，表明蚕豆具有生态适应性狭窄和极强的地域生态特点，这一结论与庞雯等（2002）的研究结果一致。加强地方蚕豆品种整理与鉴定、引种、系统选育以及杂交育种是当前蚕豆育种的主要方式。尚启兵等（2003）通过引种和系统选育成功选育出蚕豆新品系Divine，该品系具有单宁含量低、高蛋白、多抗性以及适应性广等特点，目前已经成为多个蚕豆新品种的育种亲本。吕梅媛等（2016）通过杂交育种方式成功选育出适应性广、产量较高、耐寒的蚕豆新品种云豆690。充分挖掘和利用蚕豆优异种质资源，合理选配杂交组合是蚕豆获得高产稳产的主要途径。

郝晨阳，王兰芬，贾继增，董玉琛，张学勇．2005．SSR荧光标记和银染技术的比较分析．作物学报，31（2）：144-149．

康智明，郑开斌，徐晓俞，李爱萍．2015．不同蚕豆品种农艺及品质性状的遗传多样性分析．福建农业学报，30（3）：249-252．

吕梅媛，王丽萍，杨峰，代程，于海天，何玉华．2016．广适、高蛋白优质蚕豆新品种“云豆690”选育．中国科技成果，17（18）：17-19．

马钰．2012．蚕豆SSR标记的开发及遗传连锁图谱的构建﹝硕士论文﹞．北京：中国农业科学院．

庞雯，杨示英，宗绪晓，蔡庆生，韦广天．2002．广西原产和外引蚕豆种质资源鉴定评价．植物遗传资源学报，3（4）：39-43．

尚启兵，王志刚，李云霞，温启录，张耀辉，宗绪晓．2003．蚕豆新品系Divine的筛选和利用．内蒙古农业科技，（4）：21-22．

孙源文，陈钰辉，刘富中，张映，连勇．2012．基于SSR分子标记的栽培种茄子遗传多样性分析．中国蔬菜，（22）：17-23．

王海飞，关建平，孙雪莲，马钰，宗绪晓．2011．世界蚕豆种质资源遗传多样性和相似性的ISSR分析．中国农业科学，44（5）：1056-1062．

王玲，左示敏，张亚芳，陈宗祥，黄世文，潘学彪．2015．中国南方八省（自治区）水稻纹枯病菌群体遗传结构的SSR分析．中国农业科学，48（13）：2538-2548．

王瑞，张福耀，程庆军，田承华，凌亮．2015．利用SSR荧光标记构建20个高粱品种指纹图谱．作物学报，41（4）：658-665．

王瑞云，季煦，陆平，刘敏轩，许月，王纶，王海岗，乔治军．2017．利用荧光SSR分析中国糜子遗传多样性．作物学报，43（4）：530-548．

王伟，杨文鹏，张文龙．2009．贵州48个玉米杂交种及其亲本SSR指纹图谱的构建与分析．贵州农业科学，37（11）：1-8．

徐东旭，姜翠棉，宗绪晓．2010．蚕豆种质资源形态标记遗传多样性分析．植物遗传资源学报，11（4）：399-406．

尹跃，安巍，赵建华，李彦龙，樊云芳，曹有龙．2017．枸杞品种SSR荧光指纹图谱构建及遗传关系分析．西北林学院学报，32（1）：137-141．

雍洪军，张世煌，张德贵，李明顺，李新海，郝转芳，刘晓鑫，白丽，谢传晓．2009．利用SSR荧光标记分析90个糯玉米地方品种的遗传多样性．玉米科学，17（1）：6-12．

张全芳，梁水美，李燕，刘艳艳，范阳阳，郭庆法，鲁守平，步迅．2017．基于荧光SSR标记的玉米自交系遗传结构解析．植物遗传资源学报，18（1）：19-31．

郑卓杰．1997．中国食用豆类学．北京：中国农业出版社：93-140．

周梦妍，吴金锋，许鲲，李锋，陈碧云，伍晓明．2015．甘蓝型油菜核心种质和新品种（系）的SSR等位变异分析．分子植物育种，（6）：1248-1258．

Evanno G，Regnaut S，Goudet J．2005．Detecting the number of clusters of individuals using the software structure：a simulation study．Molecular Ecology，14（8）：2611-2620．

FAO．2017．FAO Statistical Database．http：//www.fao.org．

Fernandez M，Figueiras A，Benito C．2002．The use of ISSR and RAPD markers for detecting DNA polymorphism，genotype identification and genetic diversity among barley cultivars with known origin．Theoretical and Applied Genetics，104（5）：845-851．

Gentile F，Arcaro A，Pizzimenti S，Daga M，Cetrangolo G P，Dianzani C，Lepore A，Graf M，Ames P，Barrera G．2017．DNA damage by lipid peroxidation productions：implications in cancer，inflammation and autoimmunity．AIMS Genetics，4（2）：103-137．

Gong Y M，Xu S C，Mao W H，Li Z Y，Hu Q Z，Zhang G W，Ding J．2011．Genetic diversity analysis of faba bean（Vicia fabaL．）based on EST-SSR markers．Agricultural Sciences in China，10（6）：838-844．

Link W，Dixkens C，Singh M，Schwall M，Melchinger A E．1995．Genetic diversity in European and Mediterranean faba bean germplasm revealed by RAPD markers．Theoretical and Applied Genetics，90（1）：27-32．

Peakall R，Smouse P E．2006．Genalex 6：genetic analysis in Excel．Population genetic software for teaching and research．Molecular Ecology Notes，6（1）：288-295．

Polignano G B，Alba E，Uggenti P，Scippa G．1999．Geographical patterns of variation in Bari faba bean germplasm collection．Genetic Resources and Crop Evolution，46（2）：183-192．

Rambaut A．2009．FigTree．v1.3.1．Available：http：//tree.bio.ed.ac.uk/software．

Robertson L D，El-Sherbeeny M．1991．Distribution of discretely scored descriptors in a pure line faba bean（Vicia fabaL．）germplasm collection．Euphytica，57（1）：83-92．

Senior M L，Murphy J P，Goodman M M，Stuber C W．1998．Utility of SSR for de-termining genetic similarities and relationships in maize using an agarose gel system．Crop Science，（38）：1088-1098．

Sokol E，Nijenhuis M，Sjollema K A，Jonkman M F，Pas H H，Giepmans B N G．2017．Particle bombardment of ex vivo skin to deliver DNA and express proteins．Methods in Molecular Biology，1559：107-118．

Terzopoulos P J，Bebeli P J．2008．Genetic diversity analysis of Mediterranean faba bean（Vicia fabaL．）with ISSR markers．Field Crops Research，108（1）：39-44．

Wang F，Yang T，Burlyaeva M，Li L，Jiang J，Fang L，Redden R，Zong X．2015．Genetic diversity of grasspea and its relative species revealed by SSR markers．PLoS One，10（3）：34-38．

Yang T，Fang L，Zhang X Y，Hu J G，Bao S Y，Hao J J，Li L，He Y H，Jiang J Y，Wang F，Tian S F，Zong X X．2015．Highthroughput development of SSR markers from pea（Pisum sativumL．）based on next generation sequencing of a purified Chinese commercial variety．PLoS One，10：103-107．

Zeid M，Schön C C，Link W．2004．Hybrid performance and AFLP-based genetic similarity in faba bean．Euphytica，139（3）：207-216．

Zong X，Liu X，Guan J，Wang S，Liu Q，Paull J G，Redden R．2009．Molecular variation among Chinese and global winter faba bean germplasm．Theoretical and Applied Genetics，118（5）：971-978．