叶用莴苣磷转运蛋白LsPHT1基因的克隆及其在纳米材料处理下的表达

汪玉洁 陈日远 刘厚诚 宋世威 苏 蔚 孙光闻

（华南农业大学园艺学院，广东广州 510642）

磷是植物生长发育所必需的大量营养元素之一，在能量代谢、糖分代谢、酶促反应和光合作用等过程中起着至关重要的作用，且是核酸、植素和卵磷脂的重要组成成分，在很大程度上决定了作物的产量和品质（Lynch & Beebe，1995）。目前已报道的高等植物中的磷转运蛋白基因主要有4个家族：PHT1、PHT2、PHT3和 PHT4（Poirier &Bucher，2002；Guo et al.，2008），每个家族分别含有不同数量的成员。磷转运蛋白根据Km值可以分为低亲和磷转运系统（low affinity）和高亲和磷转运系统（high affinity）两大类（Raghothama，1999；Gordonweeks et al.，2003）。近年来通过基因组测序和同源基因克隆等技术手段，从苜蓿、水稻、拟南芥、小麦、大麦、玉米、番茄、马铃薯、烟草、辣椒、茄子、百脉根、矮牵牛等的基因组中鉴定到多个编码高亲和磷转运蛋白基因（张晓，2014）。这些基因大多数属于共转运体的PHT1家族，可能具有吸收土壤溶液中低浓度可溶性磷和在植物体内运输的功能（Lin et al.，2009）。通过不同的生物信息学软件预测，PHT1家族的磷转运蛋白在结构上具有高度的相似性（李立芹，2011）。大多数植物的高亲和磷转运蛋白主要在根部表达，有的磷酸盐转运蛋白受缺磷诱导，有的则受菌根诱导，并且具有很高的特异性（Bucher，2007；Jain et al.，2007），这充分说明了根系对植物磷素吸收和利用的重要性。

纳米技术是20世纪80年代末诞生并崛起的高科技，对世界经济、工业和人们的生活产生了非常重要的影响。随着纳米材料研究的深入，其在植物上的应用也越来越广泛。越来越多的研究表明，纳米材料能在一定程度上改善植株的生长发育及其对营养元素的吸收。喷施相同含硅量的纳米硅藻土、纳米二氧化硅后，苋菜干物质量分别比对照提高43.4%和14.9%，氮磷钾吸收总量分别提高36%和20%（裴福云 等，2015）。纳米碳的加入还能提高土壤中碱解氮、速效磷、速效钾的含量，并促进玉米对N、P、K等养分的积累（王佳奇，2013）。刘秀梅（2005）研究表明，纳米—亚微米级复合材料能提高作物对褐潮土、红壤和风沙土中氮、磷、钾的吸收和利用，植株干质量及氮、磷、钾含量均显著高于对照。

南方蔬菜生理与设施研究中心在前期关于纳米材料对叶用莴苣生长发育的生理研究中，发现纳米材料可以显著增加根系对N、P、K、Zn及地上部对N、P、K、Ca的吸收（李贵莲 等，2015；苏蔚等，2015），并在此基础上进行了转录组测序（Wang et al.，2017）。在分析转录组数据的过程中，发现与磷转运蛋白相关的unigenes在处理中上调表达，因此本试验首先从叶用莴苣中克隆LsPHT1基因全长，对基因序列及其翻译的氨基酸序列进行分析；并对叶用莴苣进行纳米材料处理，结合半定量PCR和实时荧光定量PCR技术检测纳米材料处理下LsPHT1基因表达量，探讨LsPHT1参与叶用莴苣响应纳米材料的作用特性，以期为进一步研究纳米材料影响叶用莴苣生长发育的分子机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验方法

供试叶用莴苣（Lactuca sativaL.）品种为耐抽薹意大利生菜，由广东省农业科学院蔬菜研究所提供，2015年10月13日在华南农业大学园艺学院714培养箱内催芽；种子萌芽后播于装有珍珠岩的穴盘中，三叶一心时选择均匀一致的幼苗移栽至装有30 L 1/2 Hoagland全营养液的水培箱中。供试纳米材料为广州市富阳环保科技有限公司和华南农业大学新肥料研究资源中心研制生产的纳米胶片，主要成份是TiO2和ZnO，涂布于塑料片上，面积为14 cm×12 cm。

试验按每升营养液中使用纳米胶片的面积设置2个处理：CK，无纳米胶片（0 cm2·L-1）；T，1/2片纳米胶片（2.80 cm2·L-1）。每处理18株，3次重复，随机排列。移栽后第25天，随机采集3株未经纳米处理的叶用莴苣植株，分别将叶片和根系用液氮处理（样品速冻t≥1 min）后-80 ℃冰箱保存，用于RNA提取和基因克隆；纳米材料处理后第2、5、10、16、22、28、31、34天，分别于上午9：00随机选取3株叶用莴苣植株，分别将叶片、根系用液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱，用于目标基因的表达分析。

1.2 试验试剂

Trizol试剂、所有引物合成及测序工作均由Invitrogen公司完成；反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real-time）、RACE试剂盒3′-Full RACE Core Set with PrimeScript RTase、DNA marker、PMD18-T 载体、SYBR Premix ExTaqMix购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；用于DNA扩增的2×SuperStar PCR Mix购自Genestar公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 总RNA提取及cDNA第一链合成

采用Trizol法提取总RNA，利用核酸蛋白仪Nanodrop 2000测定OD260和OD280，根据OD260/OD280比值判断RNA的质量，采用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。以样品中的1 μg总RNA为模板，利用反转录试剂盒去除基因组DNA并反转录合成cDNA，作为半定量PCR和实时荧光定量PCR（q-PCR）的模板。

1.4 LsPHT1基因克隆及序列拼接

采用RACE（rapid amplification of cDNA ends）法克隆LsPHT1基因全长cDNA。通过转录组测序获得叶用莴苣磷转运蛋白基因的片段，根据此片段序列设计用于3′RACE的片段特异性引物（表1），其余操作完全按照RACE试剂盒的操作手册进行。利用DNASTAR软件将扩增得到的目的基因片段进行拼接，获得全长cDNA。根据ORF两端序列设计特异引物PHT1-F和PHT1-R，扩增该基因的编码区序列（coding sequences，CDs），PCR扩增产物经回收、纯化，与PMD18-T Vector连接，转化DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选后选取阳性克隆，送赛默飞世尔科技（中国）有限公司测序。扩增结果测序后与拼接序列进行比对，最终证实获得叶用莴苣磷转运蛋白LsPHT1基因全长。

表1 试验所需引物序列

1.5 基因表达分析

纳米材料处理后的叶用莴苣叶片和根系的总RNA提取方法同上。以叶用莴苣CAB作为内参基因，半定量RT-PCR反应体系为：cDNA 2.0 μL，10×buffer（含 Mg2+）2.0 μL，dNTPs Mixture（10 mmol·L-1）0.4 μL，TaqDNA polymerase（2 U·μL-1）0.2 μL，Primer-F 和 Primer-R（10 μmol·L-1）各1 μL，ddH2O补足至20 μL。反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。qRTPCR反应在CFX96 Real-Time PCR Detection System（BioRad公司）扩增仪上进行，每个样品重复3次。反应体系为（10 μL）：SYBR Premix ExTaqMix 5 μL，cDNA（30～35 ng·μL-1）4 μL，正向引物和反向引物的混合物（10 μmol·L-1）1 μL。反应程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，39个循环；65 ℃加热至 95 ℃，5 s。

1.6 序列分析

核苷酸序列和推导的氨基酸序列分别在NCBI网站（http：//www.ncbi.nim.nih.gov/）进行核苷酸序列比对（BLASTn）、氨基酸序列比对（BLASTp）和保守域预测；利用ProtParam程序（http：//au.expasy.org/tools/protparam.html）预测该氨基酸序列的分子量和理论等电点（pI）；利用 SignaIP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在线分析蛋白质的信号肽；利用 Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）在线分析基因亚细胞定位；利用TMHMM Server v2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对蛋白质进行跨膜分析；利用DNAMAN软件进行氨基酸序列比对；利用MEGA 5.0软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 LsPHT1的cDNA克隆

采用Trizol法提取总RNA，OD260/OD280比值在1.8～2.0之间；采用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，18 S和28 S两条核糖体清晰，质量较好，可以用于后续试验。

根据已获得的叶用莴苣转录组数据，以叶用莴苣cDNA为模板，利用特异性引物GSP1和GSP2进行半巢式3′RACE扩增，获得1条大小为703 bp的cDNA片段（图1-a）。根据所得序列拼接后的序列设计引物扩增全长，得到大小为1 605 bp的基因片段（图1-b）。

图1 LsPHT1的PCR扩增图谱

2.2 LsPHT1序列分析

通过DNASTAR软件分析得到1个cDNA的全长为1 884 bp，具有1个完整的开放阅读框，共1 605 bp，编码534个氨基酸（图2）。核苷酸序列比对结果表明，该基因的核苷酸序列与菊花（登录号：KC812501.1）同源性为81%，与烟草（登录号：XM_009766934.1）同源性为75%，推测克隆获得的基因为叶用莴苣磷转运蛋白基因，命名为LsPHT1，序列已提交NCBI，登陆号为KY305670。

利用ProtParam程序预测该氨基酸序列分子量为58.5 kD，理论pI值8.68。推测该蛋白分子式为。推导的蛋白不稳定系数为38.35，属于稳定蛋白；亲水性/疏水性分析显示，疏水区域明显大于亲水区域，说明疏水性较强，为疏水性蛋白。利用SignaIP检测该蛋白不含信号肽序列，无分泌蛋白；存在11个跨膜区，属于跨膜蛋白。亚细胞定位分析表明主要定位在细胞膜上。通过NPS程序对蛋白序列进行二级结构分析，LsPHT1蛋白由α螺旋、无规则卷曲和延伸链等结构元件组成，其中α螺旋所占比例最高，为53.00%；其次为无规则卷曲和延伸链，分别为35.96%和11.05%。对推测的LsPHT1氨基酸序列进行保守域分析，显示该序列包含1个从第25位氨基酸到504位氨基酸的保守域MFS superfamily和PHT1家族的保守特征序列：GGDYPLSATIxSE。

图2 LsPHT1 cDNA序列及其推测的氨基酸序列

利用DNAMAN软件与其他植物的PHT氨基酸序列进行比对，表明该基因与拟南芥、番茄、菊花、葡萄等多种植物的PHT高度同源（图3），其中与菊花氨基酸序列（登录号：AGK29560.1）同源性高达88%，与葡萄氨基酸序列（登录号：XP_010650086.1）同源性高达80%，充分说明植物体内PHT的高度保守性。

为进一步了解叶用莴苣PHT和其他植物之间的亲缘关系，利用软件MEGA 5.0，通过NCBI Blast比对，将LsPHT1序列推测的氨基酸序列与数据库中已登录的9种PHT氨基酸序列构建（bootstrap）系统进化树。从氨基酸序列系统进化树可以看出（图4），该基因与菊花PHT亲缘关系最近，二者同属于菊科植物；与番茄的同源关系较近。

图3 LsPHT1氨基酸序列比对结果

图4 LsPHT1氨基酸序列系统进化树

2.3 LsPHT1基因表达特性分析

以叶用莴苣根系和叶片第一链cDNA为模板，以LsCAB为内参基因，进行半定量RT-PCR扩增。结果表明，LsPHT1仅在根部表达，在叶片中表达微弱（图5）。

实时荧光定量PCR检测结果与RT-PCR检测结果相似，LsPHT1同样只在叶用莴苣根部有较高的表达，而在叶片中的表达量极低（图6）。

从图7可以看出，在叶用莴苣全生长期内，LsPHT1基因的表达量呈先上升后下降的变化趋势；在纳米材料处理第22天（即11月23日），该基因的表达量达到最大值。在生长中后期，纳米材料处理的叶用莴苣根部LsPHT1的表达量显著高于对照，说明该基因的表达受纳米材料的诱导上调。

图6 LsPHT1的实时荧光定量PCR检测结果

图7 叶用莴苣不同生长时期根部LsPHT1的表达

3 结论与讨论

磷是植物体内核酸、磷脂和ATP的重要组成成分，并且作为植物体内能量转移物质，能够活化体内蛋白质，调控植物体内的整个代谢过程（Marschner，1995）。植物中的磷转运蛋白基因是一个小基因家族，具有高度的保守性（王萍 等，2006）。根据动力学参数Km，高亲和力磷转运系统Km值在7 μmol·L-1左右，而低亲和力磷转运系统Km值在50～330 μmol·L-1之间（Schachtman et al.，1998）。绝大部分已经克隆出来的植物磷转运蛋白基因属于H+/H2PO4-共转运体的PHT1家族，都属于高亲和力的磷转运蛋白基因，即利用质膜上的氢离子浓度梯度来驱动植株对磷素的吸收，后者又归属于一个更大的溶质转运蛋白家族MFS（Raghothama，2000），这一家族的基因负责磷吸收和体内转运的基本过程。它们在结构上有着关键的相似性，都是膜整合蛋白，由12个疏水的跨膜区域组成（Robards & Lucas，1988）。本试验成功克隆了叶用莴苣的磷转运蛋白基因，命名为LsPHT1。对其氨基酸序列进行保守域分析显示，该序列包含MFS超家族的保守结构域和PHT1家族的保守特征序列：GGDYPLSATIxSE（李立芹，2011）。对其进行跨膜分析显示，叶用莴苣磷转运蛋白基因在跨膜数上与其他植物略有不同，据研究，玉米（Zea mays）磷转运蛋白ZmPT1～ZmPT9（ZmPT5除外）的跨膜区域数量在4～6个之间（张立军，2011），小麦（Triticum aestivum）磷转运蛋白TaPT1～TaPT11的跨膜区域数量在3～15个之间（郑飞，2009），而LsPHT1蛋白的跨膜区域预测有11个，这说明在植物演化过程中跨膜区域的数量出现了变化（曹庆芹 等，2013）。综合氨基酸序列同源性分析和系统进化树分析结果，LsPHT1均与菊花PHT基因同源性最高，因此推测该基因属于植物PHT基因家族成员。LsPHT1基因的获得，将有助于进一步研究叶用莴苣响应纳米材料的作用机制，深入了解纳米材料处理下叶用莴苣对磷素吸收的机理。

纳米材料发射出远红外射线（周延怀和冯玉英，2000），使水由大分子团变为小分子团，其溶解力、pH等性质发生变化，经纳米材料处理的水具有较高的溶解力，磷溶解力的提高对于作物磷营养有明显的影响（曹玉江 等，2006）。纳米材料处理对植物的磷素吸收有促进作用这一结论在本试验前期工作（Wang et al.，2015）以及许多植物的生理试验上已经得到验证。本试验中，纳米材料处理的叶用莴苣全生长期内，LsPHT1基因的表达量呈先上升后下降的变化趋势；在处理后第22天，该基因的表达量达到最大值，这可能是由于随着时间的变化，水培箱中的磷素逐渐被消耗，在缺磷条件下植物主要通过活化介质中的磷并提高介质中有效磷的吸收能力来适应低磷胁迫（张斌和秦岭，2010），即植株需通过上调磷转运蛋白基因的表达来获得生长所需的磷素。在叶用莴苣生长中后期，纳米材料处理的植株根部LsPHT1的表达量显著高于对照，表明纳米材料能够诱导LsPHT1的表达。

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